Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

Summary

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

Anastasis (그리스어 “생활에 상승”)은 그것에 의하여 일반적으로 본질적으로 가역 적인 것으로 간주 하는 단계의 세포 죽음 프로세스에 뒤집을 수 있는 세포 죽어 최근에 발견 된 세포 복구 현상. Anastasis 홍보 수 원리 구조 또는 보존 부상을 cardiomyocytes 등 신경, 조직 복구를 촉진 함으로써 대체 하기 어려운 세포. 반대로, 억제 anastasis 암 세포에 항 암 치료 후 apoptosis를 겪고 수 있습니다 암 세포 죽음 고 재발의 가능성을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이러한 연구 anastasis 살아있는 동물에서 받아야 하는 셀의 운명을 추적 하기 위한 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 복구 후 그들의 형태학 상으로 정상적인 외관에도 불구 하 고 세포 죽음 프로세스를 반전 하는 셀을 식별 하는 도전이입니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 초파리 및 식별 하 고 영구적으로 anastatic 세포 생체 외에서 또는 vivo에서추적할 수 있는 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 개발 했습니다. 여기, 우리는 생성 및 감지 하 고 세포 죽음 자극에 과도 노출 후에 초파리 melanogaster anastasis 추적 CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템의 사용에 대 한 vivo에서 프로토콜을 제시. 기존의 바이오 센서 프로토콜 수 레이블 셀 적극적으로 겪고 apoptotic 세포 죽음, 그러나 CaspaseTracker 바이오 센서 caspase 활성화-단계의 apoptosis의 각 인 후 회복 된 셀 라벨 영구적으로 수 고 동시에 활성 apoptotic 프로세스를 식별 합니다. 이 바이오 센서는 직접 또는 간접적으로 관련 된 caspase 활동 세포 죽음의 다른 형태를 시도 하는 셀의 복구를 추적할 수도 있습니다. 따라서,이 프로토콜을 수 있습니다 이러한 세포와 생물 학적 기능, 분자 메커니즘, 생리 및 병리학 결과 및 치료 의미의 미래 연구를 촉진 하는 그들의 자손의 운명을 지속적으로 추적 anastasis입니다. 우리는 또한 그 비 apoptotic caspase 활동 비보를 표시 하는 anastasis 받아야 하는 셀을 구별 하는 적절 한 컨트롤을 논의.

Introduction

프로그램 된 세포 죽음, apoptosis 등, 다세포 생물^1,2,3, 부상, 원치 않는 또는 위험한 셀을 제거 하 여 배아 개발 및 정상적인 항상성에서 중요 한 역할. 생존 세포의 죽음 사이의 균형의 손실 암, 심장 마비, 면역, 등 변성^4,5,6,,78치명적인 결과가 발생할 수 있습니다. Caspases는 전통적으로 “돌아올 수 없는 지점” apoptosis^9,,1011, 그것으로 간주 되어 사형 집행의 활성화 트리거 신속 하 고 대규모 세포 파괴¹², ^13,14,,1516. 우리는 교양된 죽어가는 기본 세포와 암 세포는 원형질 막 blebbing, 셀 수축를 포함 하 여 죽음 특징 caspase 활성화, 하지만 또한 다음과 같은 중요 한 세포 뿐만 아니라 복구할 수 있습니다 입증이 일반적인 정설에 도전, 미토 콘 드 리아 조각화, cytosol, 핵 chromatin 응축이, DNA 손상, 핵 분열에 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 의 릴리스 세포 phosphatidylserine (PS)의 표면 노출 및 apoptotic 시체의 형성 ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21}. 우리 제안 그 anastasis은 기본 셀 복구 현상으로 죽어가는 세포 세포 죽음 자극^17,,1819,20, 의 제거 후 복구할 수 있습니다 ²¹. 우리가 만들어낸 용어 “Anastasis” (Αναστάσης)¹⁸, 의미 “상승 생활” 그리스어,에이 예기치 않은 셀 복구 현상 설명. Anastasis의 우리의 관찰은 추가 phosphatidylserine 외부화^22,23,24, 미토 콘 드 리아 제한 후 세포의 복구를 또한 공개 최근 독립적인 학문에 의해 지원 되는 외부 멤브레인 permeabilization²⁵, 혼합된 계보 니 같은의 활성화 (MLKL), 그리고 세포 수축²⁶.

Anastasis 규제 메커니즘을 특성화 하는 것은 패러다임 변화 생리, 병리학, 그리고 치료 의미 있을 것 이다. Anastasis 구출 또는 왼쪽 심 실 심 실 역 중요 한 postmitotic 세포와 대체, 하기 어려운 조직 및 가능 하 게 심장 마비 반전에 대 한 계정 보존 이전에 알려지지 않은 cytoprotective 메커니즘을 나타내는 수 있습니다. 뇌 부상³²후 장치 (LVADs)^27,28, 과도 한 빛^29,,3031, 과도 노출 또는 뉴런의 수리 후 포토 리셉터 세포의 복구를 지원 합니다. Anastasis 홍보 세포 및 조직 복구를 향상 시킬 수 있도록 하는 경우. 반대로, anastasis 생존 세포 죽음을 유도 하는 치료, 암 재발^17,18을 일으키는 암 세포에 의해 사용 되는 예기치 않은 탈출 전술 수 있습니다. 따라서, 억제 anastasis 동안 암 세포 죽어 그리고 암 치료 그들의 재발을 방지 하 여 암을 치료 하는 새로운 치료 전략 수 있습니다.

Anastasis의 과정에서 우리는 일부 복구 된 셀 영구 유전 변경 취득 종양 전이 겪었다, apoptosis^{18,20,21 동안 DNA 손상으로 인해 발생 한 발견} . DNA 손상 된 세포의 죽음 과정 반전 수 tumorigenesis의 메커니즘, 식도에 만성 열 상해 유도 같은 조직, 다양 한 암 위험 증가 잠재적으로 조직 상해를 반복 관찰을 기본 차적인 암 치료^38, 후 매우 뜨거운 음료^33,,3435, 알코올 중독^36,37인 한 간 손상, 종양 진화의 소비에 의해 ³⁹⁴⁰,^,및 새로운 암 항 암 치료^41,42,,4344 의 주기 사이 간격 동안 발생 하는 정상 조직에서의 개발 . True 이면 방지 수 anastasis 타겟팅 또는 암 개발 및 진행을 체포. 우리는 죽어가는 세균 세포 기아 유도 다시 먹이 초파리¹⁹anastasis 수술을 발견 했다.  Anastasis 생식 세포 DNA 손상에서 발생 하면, 그것은 유전 질병의 개발을 촉진 하는 환경 스트레스를 장기간 관찰에 대 한 계정 수 있습니다. 예를 들어 기근 transgenerational 상속 질병 당뇨병, 관상 심장 질환⁴⁵등의 개발에 기여 한다. 따라서, 이해 anastasis 전략 개발이 잠재적인 메커니즘으로 인 한 상속 질병의 예방에 대 한 발생할 수 있습니다.

Anastasis의 발견을 활용 하 고 혁신적인 치료법 개발을 직접, 원인 anastasis 살아있는 동물에서의 결과 공부 하 고 필수적 이다. 그러나, 그것은 기술적으로 확인 하 고 anastatic 셀에 추적 vivo에서, 세포 죽음 과정에서 발견 된 셀 표시 정상적인 건강 한 세포 형태학 상으로 구별할 고 아무 biomarker anastasis의 도전 확인 아직^17,,1821. 이러한 문제를 해결 하려면 우리는 새로운 비보에 caspase 바이오 센서를 식별 하 여⁴⁶, caspase의 활성화^19,후 apoptosis를 생존 하는 셀 추적 “CaspaseTracker”¹⁹, 지정을 최근 개발 된 apoptosis^10,14각 인이 고 “실시간” caspase 바이오 센서 등 배설물^12,47, Apoliner⁴⁸, 캘리포니아-GFP⁴⁹, ApoAlert^18,50, C3AIs⁵¹ iCasper^{52에서 구별} 는 온가 caspase 활동 감지, CaspaseTracker 바이오 센서 또한 기능을 영구적으로 셀 익스프레스 caspase 활동 정도 능력. 따라서, CaspaseTracker 바이오 센서는 caspase 중재의 세포 죽음 과정 비보후 anastasis의 장기 추적을 하면 수 있습니다.

Protocol

CaspaseTracker 바이오 센서의 1) 준비 CO2, 파리 anesthetize를 사용 하는 붓 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 같은 유리병에 7 ~ 10 caspase 민감한 Gal4 (DQVD)19 처녀 암컷과 7 10 G-추적53 Gal4 기자 젊은 남성 파리 (또는 반대로) 전송.참고: 크로스 (DQVD)에 민감한 Caspase Gal4 및 G-추적 파리의 CaspaseTracker 자손 파리를 생산할 예정 이다. Caspase-에</em…

Representative Results

시간 경과 라이브 셀 현미경은 배양된 세포20로 anastasis 신뢰할 수 있는 방법, 그것은 복구 된 셀 표시 형태학 상으로 구별할 수 있기 때문에 셀 동물, anastasis 받은 식별 하는 도전 정상적인 건강 한 세포에서 세포 죽음 시도 하지는. 예를 들어 인간의 자궁암 HeLa 세포 세포 죽음에 대 한 응답에서 apoptosis1,,214, 세…

Discussion

CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템은 소설과 최근의 탐지를 허용 하는 독특한 도구 또는 지속적인 caspase 활동, 세포 죽음을 반대 해야 하는 셀을 추적 하 고 프로세스 caspase 활동에서 vivo에서발생 후 생존. Caspase 활동 apoptosis의 특징으로 전통적으로 생각 되었습니다, 하는 동안 성장 연구 공개 비 apoptotic caspase 활동 신경 활동^79, 의 규칙 등?…

Materials

CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium	Vector Products	H-1000	Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI)	Vector Products	H-1200	Antifade mounting medium with DAPI
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Mitotracker Red CMXRos	Molecular Probes	M-7512	Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS)	Sigma-Aldrich	A8806	Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline	VWR	114-056-101	Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent for cell permeabilization
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W	AmScope	WBM99316	Light source