Påvisning af Anastasis In Vivo af CaspaseTracker Biosensor

Summary

Anastasis teknisk udfordrende for at opdage i vivo , fordi de celler, der har vendt den celle død proces kan være morfologisk umulig at skelne fra normale sunde celler. Her beskriver vi protokoller til påvisning og spore celler, der undergår anastasis i levende dyr ved hjælp af vores nyudviklede i vivo CaspaseTracker biosensor system.

Abstract

Anastasis (græsk for “stigende til liv”) er en nylig opdaget celle opsving fænomen hvor døende celler kan tilbageføre sene celle død processer, som generelt antages for at være uløseligt irreversibel. Fremme anastasis kunne i princippet redning eller Bevar sårede celler, der er svære at erstatte såsom cardiomyocytes eller neuroner, dermed at lette væv opsving. Omvendt, undertrykke anastasis i kræftceller, undergår apoptose efter anti-kræft behandlinger, kan sikre kræft celledød og mindske risikoen for tilbagefald. Men disse undersøgelser har været hæmmet af manglen på værktøjer til at spore skæbnen af celler, der undergår anastasis med levende dyr. Udfordringen er at identificere de celler, der har vendt celle dødsprocessen trods deres morfologisk normale udseende efter helbredelse. For at overvinde denne vanskelighed, har vi udviklet Drosophila og pattedyr CaspaseTracker biosensor systemer, der kan identificere og permanent spore anastatic celler in vitro eller i vivo. Vi præsenterer her, i vivo protokoller til produktion og brug af CaspaseTracker dual biosensor system til at registrere og spore anastasis i Drosophila melanogaster efter forbigående eksponering for celle død stimuli. Mens konventionelle biosensorer og protokoller kan mærke cellerne aktivt undergår apoptotisk celledød, CaspaseTracker biosensor permanent kan mærke celler, der har genvundet efter caspase aktivering – kendetegnende for sene apoptose, og samtidig identificere aktive apoptotiske processer. Denne biosensor kan også spore inddrivelse af de celler, der forsøgte andre former for celledød, der direkte eller indirekte involveret caspase aktivitet. Derfor, denne protokol giver os løbende spore disse celler og deres afkom, lette fremtidige studier af biologiske funktioner, molekylære mekanismer, fysiologiske og patologiske konsekvenser og terapeutiske virkninger af skæbne Anastasis. Vi diskuterer også de passende kontrol for at skelne mellem celler, der undergår anastasis fra dem, der viser ikke-apoptotiske caspase aktivitet in vivo.

Introduction

Programmeret celledød, såsom apoptose, spiller en væsentlig rolle i embryonale udvikling og normal homøostase ved at fjerne uønskede, tilskadekomne eller farlige celler i flercellede organismer^1,2,3. Tab af balance mellem celledød og overlevelse kan føre til fatale konsekvenser som kræft, hjertesvigt, autoimmunitet og degeneration^4,5,6,7,8. Aktivering af bøddel caspases har traditionelt været betragtet som “point of no return” i apoptose^9,10,11, som det udløser hurtig og massiv cellulære nedrivning^{12, 13,14,15,16}. Udfordrende denne generelle dogme, viste vi at kulturperler døende primære celler og kræftceller kan genoprette ikke kun efter caspase aktivering, men også følgende vigtige celle død kendetegnende herunder plasma membran blebbing, celle svind, mitokondrie fragmentering, frigivelse af mitokondrie cytokrom c i cytosol, nukleare og kromatin kondens, DNA-skader, nukleare fragmentering, celle overflade eksponering af Phosphatidylserin (PS), og dannelsen af apoptotiske organer ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21}. foreslår vi at anastasis er en iboende celle opsving fænomen, som døende celler kan genoprette efter fjernelse af celle død stimuli^{17,18,19,20, 21}. Vi opfandt udtrykket “Anastasis” (Αναστάσης)¹⁸, hvilket betyder “stiger til livet” på græsk, at beskrive fænomenet uventede celle opsving. Vores observation af anastasis understøttes yderligere af de seneste uafhængige undersøgelser, der også afslører inddrivelse af celler efter phosphatidylserin udlægning^22,23,24, begrænset mitokondrie ydre membran permeabilization²⁵, aktivering af blandet lineage kinase-lignende (MLKL), og celle svind²⁶.

Kendetegner de mekanismer, der regulerer anastasis vil have paradigme-shifting fysiologiske, patologiske og terapeutiske virkninger. Anastasis kunne repræsentere en hidtil ukendt cytoprotective mekanisme til at redde eller bevare vigtige postmitotic celler og væv, der er vanskelig at erstatte, og eventuelt konto for hjertesvigt tilbageførsel af ventrikulær losning med venstre ventrikel hjælpe enheder (LVADs)^27,28, inddrivelse af fotoreceptor celler efter forbigående eksponering af overdreven lys^29,30,31, eller reparation af neuroner efter hjernen skade³². Hvis så fremme anastasis kunne øge celle og væv opsving. Omvendt kunne anastasis være en uventet undslippe taktik bruges af kræftceller til at overleve celle-død-inducerende terapi, forårsager kræft tilbagefald^17,18. Derfor, undertrykke anastasis døende kræftceller under og efter kræftbehandling kan være en roman terapeutisk strategi at helbrede kræft ved at forhindre deres tilbagefald.

Under processen med anastasis, har vi fundet at nogle gendannede celler erhvervet permanent genetiske ændringer og undergik muterede transformation, sandsynligvis på grund af DNA-skader opstået under apoptose^18,20,21 . Vende dødsprocessen af DNA-beskadigede celler kunne være en mekanisme af tumordannelse, potentielt underliggende den observation, at gentagne vævsskade øger risikoen for kræft i en række forskellige væv, såsom kronisk termisk skade i spiserøret induceret ved indtagelse af meget varme drikke^33,34,35, leverskader på grund af alkoholisme^36,37, tumor udvikling efter genotoksiske kræft terapi^{38, 39,40}, og udvikling af nye kræfttilfælde fra normale væv, der opstår under intervallerne mellem cyklusser af anti-cancer terapi^41,42,43,44 . Hvis sand, kunne målretning anastasis forhindre eller anholde kræft udvikling og progression. Vi har fundet, at sult-induceret døende kønsceller gennemgå anastasis i re fodret Drosophila¹⁹.  Hvis anastasis forekommer i kimceller med DNA-skader, kunne det være konto for den iagttagelse, at langvarig miljømæssige stress fremmer udviklingen af genetiske sygdomme. For eksempel, bidrage hungersnød til udviklingen af transgenerationel arvelige sygdomme som diabetes og koronar hjertesygdomme⁴⁵. Derfor kunne forståelse anastasis føre til strategier til forebyggelse af udvikling af arvelige sygdomme forårsaget af denne potentielle mekanisme.

For at udnytte opdagelsen af anastasis og direkte til at udvikle innovative behandlinger, er det vigtigt at undersøge årsag og konsekvens af anastasis med levende dyr. Men det er en teknisk udfordring at identificere og spore anastatic celler i vivo, fordi de celler, der inddrives fra celle dødsprocessen vises morfologisk umulig at skelne fra normale raske celler, og der er ingen biomarkør for anastasis identificeret endnu^17,18,21. For at løse disse problemer, vi for nylig udviklet en ny i vivo caspase biosensor udpeget “CaspaseTracker”¹⁹, til at identificere og spore celler, der overlever apoptose efter caspase aktivering^19,46, den Hallmark af apoptose^10,14. Adskiller det fra “real-time” caspase biosensorer såsom SCAT^12,47, Apoliner⁴⁸, CA-normal god landbrugspraksis⁴⁹, ApoAlert^18,50, C3AIs⁵¹ og iCasper⁵² der registrerer løbende caspase aktivitet, CaspaseTracker biosensor desuden egenskaber evne hen til permanent mærke cellerne at udtrykke caspase aktivitet selv forbigående. Derfor muliggør CaspaseTracker biosensor lang sigt sporing af anastasis efter tilbageførsel af caspase-medieret celle død proces in vivo.

Protocol

1) forberedelse af CaspaseTracker Biosensor fluer Bedøver fluer med CO2, og brug en pensel til at overføre 7 til 10 caspase-følsomme Gal4 (DQVD)19 jomfruelige hunner og 7 til 10 G-Trace53 Gal4 reporter unge mandlige fluer (eller omvendt) i den samme hætteglas med flyve mad og frisk gær pasta.Bemærk: Tværs af Caspase-følsomme (DQVD) Gal4 og G-Trace fluer vil producere CaspaseTracker afkom fluer. Krydse af Caspase -if…

Representative Results

Mens time-lapse levende celle mikroskopi er en pålidelig metode til tarmkanalen anastasis i kulturperler celler20, er det udfordrende at identificere, hvilke celler har undergået anastasis i dyr, fordi de gendannede celler vises morfologisk skelnes fra normale sunde celler, der ikke har forsøgt celledød. For eksempel, vises menneskelige livmoderhalskræft HeLa celler morfologiske kendetegnende for apoptose1,2,<sup class="xre…

Discussion

CaspaseTracker dobbelt biosensor system er en roman og unikt værktøj, der tillader detektering af de seneste eller igangværende caspase aktivitet, og sporing af celler, der har vendt celledød og overleve efter at have oplevet caspase aktivitet i vivo. Mens caspase aktivitet er traditionelt blevet antaget som kendetegnende for apoptose, viser voksende undersøgelser, at ikke-apoptotiske caspase aktivitet spiller potentielle roller i forskellige normal cellefunktioner, såsom r…

Materials

CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium	Vector Products	H-1000	Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI)	Vector Products	H-1200	Antifade mounting medium with DAPI
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Mitotracker Red CMXRos	Molecular Probes	M-7512	Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS)	Sigma-Aldrich	A8806	Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline	VWR	114-056-101	Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent for cell permeabilization
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W	AmScope	WBM99316	Light source