Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi
Summary
Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.
Abstract
Metilasyon, farklı doku tiplerinin istikrarlı gelişimi ve farklılaşması için gereken genlerin kesin düzenlenmesinden sorumlu olan DNA, için gerekli epigenetik değişiklikler biridir. Bu sürecin düzensizliği sık sık kanser gibi çeşitli hastalıkların özelliğidir. Burada, son sıralama tekniklerden birini anahat, Metil-Bağlama geniş hasta grupları için çeşitli normal ve hastalık dokularda metilasyonu ölçmek için kullanılan DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq). Biz en uygun kantifikasyon ulaşmak için biyoinformatik boru hattı ile birlikte bu afinite zenginleştirme yaklaşımı ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu teknik, 1000 methylome projesi (Kanser Methylome sistemi) bir parçası olarak çeşitli kanser türlerinde hastanın yüz sıralamak için kullanılmaktadır.
Introduction
DNA metilasyonu yoluyla gen epigenetik düzenlemesi gövde 1 'de, farklı doku tiplerinin stabil farklılaşması, hücre akıbetini belirlemek için gerekli olan temel mekanizmalardan birisidir. Bu işlemin bozulması kanseri 2 de dahil olmak üzere, çeşitli hastalıklara sebep olduğu bilinmektedir.
Bu işlem, esas olarak DNA 3 CpG dinükleotidleri sitozin tortu üzerindeki metil gruplarının eklenmesini içerir. Şu anda birçok çalışmada 2-8 belirtildiği gibi her biri kendi avantajları olan, bu mekanizmayı araştırmak için kullanılan birkaç farklı teknikler vardır. İşte biz DNA'nın metillenmiş bölgeleri tanımlamak için bir afinite zenginleştirme tekniği kullanmak (MBDCap seq) Metil-Bağlama DNA Yakalama dizi olarak adlandırılan bu tekniklerin birini tartışacağız. Bu teknik, metile CpG ihtiva eden genomik DNA parçaları için ettirecek MBD2 proteininin metil-bağlanma yeteneği üzerine inşa edilmiştir. Bu, ticari bir metillenmiş DNA zenginleştirme kiti kullanmaktadırBu metile bölgelerin izole edilmesi için. Laboratuvarımız bu tekniği kullanarak hasta numunelerinin yüzlerce ekranlı ve burada büyük hasta kohortlarında araştırmak için kullanılabilecek kapsamlı bir optimize protokol sağlamak.
Herhangi bir yeni nesil dizileme teknolojisi ile belirgin olarak, MBDCap seq de doğru örneklerin arasında metilasyon seviyelerini ölçmek amacıyla belirli bir biyoinformatik yaklaşım gerektirir. Sıralama verilerine 9, 10 normalleşmesi ve analiz sürecini optimize etmek amacıyla birçok yeni çalışmalar olmuştur. LONUT – – hasta örneklerinin çok sayıda genelinde tarafsız karşılaştırmalar etkinleştirmek için her numunenin doğrusal normalleşme ve ardından bu protokolde, benzersiz bir okuma kurtarma yaklaşımı uygulayan aşağıdaki yöntemlerden birini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBDCap seq tekniği hastalar 15 çok sayıda kohortları araştırılırken maliyetli bir alternatif olarak kabul bir afinite zenginleştirme yaklaşımı 3 vardır. Burada sunulan boru hattı veri analizi ve yorumlanması örnek temininden kapsamlı bir yaklaşım anlatılmaktadır. En önemli adımlardan biri DNA metilasyonu meydana geldiği bu gibi genomunda GC zenginleştirilmiş bölgelerinin PCR verimliliğini artırmak için bir PCR prosedürü kuruyor. Ayrıca, dizi analizi sonrasında, her bir örnek benzersiz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
iş CPRIT Araştırma Eğitim Ödülü RP140105 tarafından desteklenen yanı sıra kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 GM114142 verir tarafından ve William & Ella Owens Tıbbi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
Riferimenti
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
