Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å undersøke genome wide DNA metylering i storskala klinisk pasientscreeningstudier ved hjelp av metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq eller MBD-seq) teknologi og påfølgende bioinformatikk analyse rørledning.

Abstract

Metylering er en av de essensielle epigenetiske modifikasjoner av DNA, som er ansvarlig for nøyaktig regulering av gener som er nødvendige for stabil utvikling og differensiering av forskjellige vevstyper. Dysregulering av denne prosessen er ofte kjennetegnet av forskjellige sykdommer som kreft. Her skisserer vi en av de siste sekvense teknikker, metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq), som brukes for å kvantifisere metylering i ulike normale og sykdom vev for store pasient kohorter. Vi beskriver en detaljert protokoll av denne affinitet anrikning tilnærming sammen med en bioinformatikk rørledning for å oppnå optimal kvantifisering. Denne teknikken har blitt brukt for å sekvensere på flere hundre pasienter på tvers av ulike cancertyper som en del av den 1000 methylome prosjektet (Cancer Methylome System).

Introduction

Epigenetisk regulering av gener som gjennom DNA-metylering er en av de grunnleggende mekanismer som er nødvendige for å bestemme den celle skjebnen ved stabil differensiering av forskjellige typer vev i kroppen ^en. Dysregulering av denne prosessen har vært kjent for å forårsake forskjellige sykdommer, inkludert kreft ^2.

Denne prosessen innebærer i hovedsak tilsetning av metylgrupper i cytosin resten i CPG-dinukleotider av ^DNA-3. Det finnes flere ulike teknikker som i dag brukes for å undersøke denne mekanismen, som hver har sine egne fordeler som skissert i mange studier ^2-8. Her vil vi diskutere en av disse teknikkene kalles metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq), hvor vi bruker en tilhørighet berikelse teknikk for å identifisere denaturert regioner av DNA. Denne teknikk bygger på den metyl-bindingsevnen av proteinet MBD2 for å anrike for de genomiske DNA-fragmenter inneholdende metylerte CpG-områder. Vi bruker en kommersiell metylert DNA berikelse kitfor isolering av disse metylert regionene. Vårt laboratorium har vist hundrevis av pasientprøver ved hjelp av denne teknikken, og her gir vi en omfattende optimalisert protokollen, som kan brukes til å undersøke store pasient kohorter.

Som tydelig med noen neste generasjons sekvenseringsteknologi, MBDCap-seq krever også en bestemt bioinformatikk tilnærming for å nøyaktig kvantifisere nivåene av metylering over prøvene. Det har vært mange nylige studier i et forsøk på å optimalisere normalisering og analyseprosessen av sekvenseringsdataene ^{9, 10.} I denne protokollen, viser vi en av disse metodene implementere en unik lese utvinning tilnærming – LONUT – etterfulgt av lineær normalisering av hver prøve for å gjøre det mulig objektive sammenligninger mellom stort antall pasientprøver.

Protocol

Alle vev oppnås etter godkjennelsen av Institutional Review Board komiteen og når alle deltakerne samtykket til både molekylære analyser og oppfølgingsstudier. Protokollene er godkjent av humane studier Utvalget ved University of Texas Health Science Center i San Antonio. 1. metyl-binding DNA Capture (MBDCap) Prøvetaking og DNA Samle bulk svulst eller prøver normale vev fra pasient parafin innebygd vevsprøver. Bruk en kommersiell DNA mini kit å isolere geno…

Representative Results

Vi har benyttet MBDCap-seq å studere DNA-metylering endringer hos et stort antall pasienter fra forskjellige krefttyper, inkludert bryst 12, endometrial 13, prostata 14, og lever kreft blant andre. Her viser vi litt informasjon fra brystkreft studie publisert nylig 12. I dette tilfellet brukte vi hele genomet sekvense tilnærming for å identifisere CpG-øyene som er differensielt metylert i tumor med hensyn til normalen på tvers av forskjellige genomiske regioner. Undersøkelsen viste at av tot…

Discussion

Den MBDCap-seq teknikk er en tilhørighet berikelse tilnærming ^3, regnes som et kostnadseffektivt alternativ når etterforsker kohorter med et stort antall pasienter ^15. Rørledningen som presenteres her beskriver en helhetlig tilnærming fra prøve innkjøp til dataanalyse og tolkning. Et av de viktigste trinn er å sette opp en PCR-amplifisering fremgangsmåte for å forbedre effektiviteten av PCR GC anriket regioner i genomet som dette er hvor DNA-metylering inntreffer. Dessuten er det viktig å sikre at etter sekv…

Materials

Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3M sodium acetate pH 5.2	Sigma	S7899	100ml
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina