פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis
Summary
Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Abstract
T רגולטוריים (T reg) תאים, המבטאים Foxp3 כגורם שעתוק, הם תת קבוצות של תאים מסוג CD4 + T. תאי רג T לשחק תפקידים מכריעים בסובלנות חיסונית ותחזוקה הומאוסטזיס על ידי ויסות התגובה החיסונית. התפקיד העיקרי של תאי T reg היא לדכא התפשטות של מפעיל T (EFF T) התאים ואת הייצור של ציטוקינים כגון IFN-γ, TNF-α, IL-2. הוכח כי היכולת של תאי רג T לעכב את תפקודם של תאי EFF T מוגברת במהלך זיהום הפתוגן מתמשך התפתחות הסרטן. כדי להבהיר את תפקודם של תאי רג T בתנאי מנוחה או מודלק, מגוון של מבחני דיכוי במבחנה באמצעות תאי reg עכבר או אדם T כבר המציא. המטרה העיקרית של המחקר היא לפתח שיטה כדי להשוות את ההבדלים הפנוטיפ ותפקוד מדכא בין מנוחת רג T מופעלתאים. כדי לבודד תאי רג T מופעלים, עכברים נדבקו בנגיף choriomeningitis לימפוציטית (LCMV) השיבוט 13 (CL13), זן כרוני של LCMV. תאי רג T המבודדים מן הטחול של LCMV עכברי CL13 נגועים הציגו הוא הפנוטיפ מופעל ופעילות מדכאת משופרת בהשוואת נח תאי רג T מבודדים מעכברים נאיביים. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול הבסיסי לניתוח פנוטיפ vivo לשעבר להבחין בין תאי רג T מופעלים מתוך נח תאי רג T. יתר על כן, אנו מתארים פרוטוקול למדידת הפעילות המדכאת של תאי רג T יופעלו באופן מלא.
Introduction
T רגולטוריים (T reg) תאים להביע forkhead תיבת P3 (Foxp3) כגורם שעתוק להתפתחותם ותפקוד 1. בנוסף, תאים רג T לבטא מולקולות שונות אחרות כגון CD25 2, הלימפוציטים-הפעלת הגן 3 (LAG-3) 3, TNF-induced בסטרואידים קולטן 4, ו T ציטוטוקסיים לימפוציט הקשורים חלבון 4 (CTLA-4) 5 על פני השטח או באזור התאי שלהם. במהלך זיהום כרוני עם סוגים שונים של פתוגנים כמו וירוסים 6,7, חיידקים 8,9, וטפילי 10-12, או במהלך התפתחות סרטן 13,14, תאי רג T נעשים שונים לתאים מופעלים, מוצגים פונקציה מדכאת משופרת מיקוד מפעיל CD4 + ו- CD8 + T תאים. מספר העיתונים הציע כי תאי T reg מורחבים והופעלו לתרום respons תא CD8 + T לקוידואר במהלך רטרו-וירוס חבר (ע"ע) זיהום 15-17. FV-induced תאי רג T לעכב IFN-γ או ביטוי granzyme B תגובתיות ציטוטוקסיות של תאי CD8 + T 15-17. יתר על כן, במודל זיהום בנגיף הרפס סימפלקס, נמסר דלדול של תאי reg CD4 + CD25 + T הביא להרחבת תאים + T CD8 ספציפי וירוס ניזק לרקמות קשה על ידי חדירה של תאי immunopathogenic CD4 + T 18-20.
עכברים נגועים באופן כרוני עם זן שיבוט 13 של וירוס choriomeningitis לימפוציטית (LCMV CL13) 21-24 היה בשימוש נרחב כדי לאפיין את הפנוטיפ ותפקוד של תאי T המפעיל (EFF T) ותאי T reg במהלך זיהום בנגיף כרוני. במהלך זיהום LCMV מתמשך, תאי T eff-ספציפי וירוס בהדרגה לאבד פונקצית המפעיל שלהם ולהיות T מותש (exh T) תאים. מצד שני, Tתאים reg לחזק את יכולתם לדכא T בתגובה תאים ספציפיים וירוס 25. הירידה ביכולת התפקוד של תאי T EFF יכולה להיות מוסברת על ידי מספר גורמים כגון גברת ביטוי של קולטנים מעכבים על תאי EFF T, פונקציה שינתה של תאי מציגי אנטיגן, ייצור של ציטוקינים immunoregulatory, ותדירות מוגברת או פונקציה משופרת של רג T תאים 26. בין הגורמים המעורבים דיכוי של תאי T, מתוכנת בתא הנידונים למוות חלבון-1 (PD-1) תאי T exh -expressing ותאי רג T כבר נחשב בעיני רבים מסימני ההיכר של התמדה אנטיגן וסביבה מדכאים. לאחרונה, דווח כי מצור של המסלול PD-1 ו אבלציה של תאי רג T להוביל תפקוד תא T משופר וירידת עומס נגיפי במהלך הזיהום הכרוני LCMV 27. יתר על כן, תאי רג T מופעלים במהלך זיהום כרוני של עכברים עם LCMV 23,25 </sעד> והתפקוד המדכא שלהם מתחזק 25. PD-1 מבוטא בכמות גבוהה בתאי רג T וכן תאי exh T, ורמת PD-1 הביע ידי תאי T reg בקורלציה עם עוצמת הפונקציה המדכאת שלהם לעכב T תא התפשטות 25.
כאן אנו מתארים שיטה כדי להשוות את המאפיינים של תאי T reg מופעלים מבודדים עכברים נגועים עם LCMV CL13 ותאי reg מנוחת T מבודד מעכברים נאיביים. יתר על כן, נסביר שורה של תהליכים להפריד תאי רג T מופעלים ולבחון vivo לשעבר הפנוטיפ שלהם, כמו גם למדוד את הפעילות המדכאת שלהם במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אמנם רק מספר קטן של תאי רג T קיים בעכברים ובבני אדם, חשוב להבין את תפקידם כפי שהם ממלאים תפקיד מכריע בויסות התגובה החיסונית ושמירת סובלנות חיסונית. מספר הפונקציות מדכאות של T רג עליות תאים במהלך זיהום בנגיף כרוני 15-20 וכן התקדמות סרטן 13,14. זהו ככל …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
Materials
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
| Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
| PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
| L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
| Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
| CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
| Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
Riferimenti
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
