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Immunologia e infezioni

प्ररूपी और सक्रिय विनियामक टी कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण क्रोनिक लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस से संक्रमित चूहों से अलग

Published: June 22, 2016
doi:
10.3791/54138
, ,
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology,Yonsei University

Summary

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Abstract

विनियामक टी (टी रेग) कोशिकाओं है, जो एक प्रतिलेखन कारक के रूप में Foxp3 एक्सप्रेस, सीडी 4+ टी कोशिकाओं का उपसमुच्चय है। टी कोशिकाओं reg प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विनियमन के द्वारा प्रतिरक्षा सहिष्णुता और homeostasis रखरखाव करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टी reg कोशिकाओं की प्राथमिक भूमिका प्रेरक टी टी (EFF) कोशिकाओं के प्रसार को और ऐसे IFN-γ, TNF-α, और आईएल -2 के रूप में साइटोकिन्स के उत्पादन को दबाने के लिए है। यह दिखा दिया है कि टी कोशिकाओं reg 'टी eff कोशिकाओं के कार्य को बाधित करने की क्षमता लगातार रोगज़नक़ संक्रमण और कैंसर के विकास के दौरान बढ़ाया है। आराम या सूजन की शर्तों के तहत टी reg कोशिकाओं के समारोह, इन विट्रो दमन माउस या मानव टी reg कोशिकाओं का उपयोग assays की एक किस्म तैयार किया गया है स्पष्ट करने के लिए। इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य phenotype और आराम के बीच दमनकारी समारोह में मतभेद और सक्रिय टी reg तुलना करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए हैकोशिकाओं। सक्रिय टी reg कोशिकाओं को अलग करने के लिए, चूहों LCMV की एक पुरानी तनाव लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस (LCMV) क्लोन 13 (CL13) से संक्रमित थे। LCMV CL13 संक्रमित चूहों की तिल्ली से अलग टी reg कोशिकाओं टी reg भोले चूहों से अलग कक्षों आराम के साथ तुलना में दोनों सक्रिय phenotype और बढ़ाया दमनकारी गतिविधि का प्रदर्शन किया। यहाँ, हम टी कोशिकाओं reg आराम से सक्रिय टी कोशिकाओं reg भेद करने के लिए पूर्व vivo phenotype के विश्लेषण के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन। इसके अलावा, हम पूरी तरह से सक्रिय टी reg कोशिकाओं की दमनकारी गतिविधि की माप के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Introduction

विनियामक टी (टी रेग) कोशिकाओं को उनके विकास और समारोह 1 के लिए एक प्रतिलेखन कारक के रूप में forkhead बॉक्स पी 3 (Foxp3) व्यक्त करते हैं। इसके अतिरिक्त, टी reg कोशिकाओं CD25 2, लिम्फोसाइट सक्रियण जीन 3 (अंतराल 3) 3, glucocorticoid प्रेरित ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर 4, और साइटोटोक्सिक के रूप में विभिन्न अन्य अणुओं को व्यक्त टी लिम्फोसाइट जुड़े प्रोटीन 4 (CTLA-4) 5 उनकी सतह या intracellular क्षेत्र पर। जैसे वायरस 6,7, 8,9 बैक्टीरिया और परजीवी 10-12, या कैंसर के विकास 13,14 के पाठ्यक्रम के रूप में रोगाणुओं की विभिन्न प्रकार के साथ पुराने संक्रमण के दौरान, टी कोशिकाओं को सक्रिय reg कोशिकाओं में विभेदित हो जाते हैं, बढ़ाया दमनकारी समारोह प्रदर्शित लक्षित करने प्रेरक सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं। कागज के एक नंबर सुझाव दिया है कि विस्तार किया है और सक्रिय टी कोशिकाओं reg बिगड़ा सीडी 8 + टी सेल respons के लिए योगदानदोस्त रेट्रोवायरस (FV) संक्रमण 15-17 दौरान ई। FV प्रेरित टी कोशिकाओं reg IFN-γ या granzyme बी अभिव्यक्ति और सीडी 8 + टी कोशिकाओं 15-17 के साइटोटोक्सिक जेट रोकना। इसके अलावा, एक दाद सिंप्लेक्स वायरस के संक्रमण मॉडल में, यह सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं की reg कि कमी की सूचना मिली थी वायरस-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं और immunopathogenic सीडी 4+ टी कोशिकाओं 18-20 की घुसपैठ से गंभीर ऊतकों को नुकसान के विस्तार में हुई।

लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस का क्लोन 13 तनाव के साथ लंबे समय से संक्रमित चूहों (LCMV CL13) 21-24 व्यापक रूप से पुरानी वायरस के संक्रमण के दौरान phenotype और प्रेरक टी कोशिकाओं (टी EFF) और टी reg कोशिकाओं के समारोह को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लगातार LCMV संक्रमण के दौरान, वायरस विशेष टी कोशिकाओं eff उत्तरोत्तर उनकी प्रेरक समारोह खोना और थक टी (टी exh) कोशिकाओं हो जाते हैं। दूसरी ओर, टी परreg कोशिकाओं वायरस विशेष टी सेल प्रतिक्रिया 25 को दबाने के लिए उनकी क्षमता को सुदृढ़। टी eff कोशिकाओं के कामकाज की क्षमता में कमी ऐसी टी eff कोशिकाओं पर निरोधात्मक रिसेप्टर्स की अपरेगुलेशन, प्रतिजन कोशिकाओं पेश की बदल समारोह, immunoregulatory साइटोकिन्स के उत्पादन, और वृद्धि की आवृत्ति या टी reg की बढ़ी समारोह के रूप में कई कारकों से समझाया जा सकता है कोशिकाओं को 26। टी सेल दमन में शामिल कारकों के अलावा, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु प्रोटीन -1 (पीडी -1) -expressing टी exh कोशिकाओं और टी कोशिकाओं reg व्यापक रूप से प्रतिजन दृढ़ता और दमनकारी पर्यावरण की पहचान के रूप में माना गया है। हाल ही में, यह बताया कि पीडी -1 मार्ग और टी reg कोशिकाओं के पृथक की नाकाबंदी बढ़ाया टी सेल समारोह के लिए नेतृत्व और LCMV पुराने संक्रमण 27 के दौरान वायरल लोड कम था। इसके अलावा, टी कोशिकाओं reg LCMV 23,25 के साथ चूहों के पुराने संक्रमण के दौरान सक्रिय रहे हैं </sअप> और उनके दमनकारी समारोह 25 को मजबूत किया है। पीडी -1 अत्यधिक टी reg कोशिकाओं पर साथ ही टी कोशिकाओं exh व्यक्त किया है, और पीडी -1 टी reg कोशिकाओं द्वारा व्यक्त के स्तर पर उनकी दमनकारी समारोह की ताकत टी सेल प्रसार 25 को बाधित करने के साथ संबद्ध।

यहाँ, हम सक्रिय टी reg LCMV CL13 और आराम टी reg भोले चूहों से अलग कोशिकाओं से संक्रमित चूहों से अलग कक्षों की विशेषताओं की तुलना करने के लिए एक विधि का वर्णन। इसके अलावा, हम प्रक्रियाओं को सक्रिय टी reg कोशिकाओं को अलग किया और उनकी पूर्व vivo phenotype की जांच के साथ-साथ इन विट्रो में उनकी दमनकारी गतिविधि को मापने के लिए की एक श्रृंखला समझाओ।

Protocol

इस अध्ययन में, चूहों Yonsei विश्वविद्यालय के Yonsei प्रयोगशाला पशु रिसर्च सेंटर की एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त सुविधा में बनाए रखा गया। सभी पशु प्रयोगों Yonsei विश्वविद्यालय में Yonsei प्रयोगशाला पशु अनुसंधान केन्द्…

Representative Results

हम उन्हें नसों के LCMV CL13 के 2 एक्स 10 6 pfu के साथ इंजेक्शन लगाने के द्वारा लगातार वायरस के संक्रमण के साथ चूहों उत्पन्न। टी reg कोशिकाओं और पुरानी वायरस के संक्रमण के दौरान टी कोशिकाओं में …

Discussion

हालांकि केवल टी reg कोशिकाओं की एक छोटी संख्या चूहों और इंसानों में मौजूद हैं, यह रूप में वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने और प्रतिरक्षा सहिष्णुता बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

Materials

FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714 Use this reagent for cell surface staining.
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655 Use this reagent for cell surface staining.
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cell strainer, 70mm BD Biosciences 352350 Use this strainer for grinding the whole spleen.
Cell strainer, 40mm BD Biosciences 352340 Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1X) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901 Use this column for Treg cell isolation
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401 Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation
EDTA, 0.5M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences Flow cytometer*
Flowjo TreeStar Flow cytometry software†
Hematocytomer Marienfeld superior
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Riferimenti

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Regulatory T CellsChronic Lymphocytic Choriomeningitis VirusPhenotypic AnalysisFunctional AnalysisIn Vitro SuppressionCD4+CD25+ CellsCD8+ Responder T CellsAnti-CD3/CD28 BeadsCytokine Production
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Citazione di questo articolo
Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).
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