Qui, descriviamo un protocollo per analizzare il fenotipo delle cellule T regolatorie (Treg) isolate da topi naïve e cronici infetti dal virus della coriomeningite linfatica. Inoltre, forniamo un processo per valutare l'attività soppressiva delle cellule Treg.
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Articolo metodologico
Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Regolamentazione delle cellule T (T reg), che esprimono Foxp3 come un fattore di trascrizione, sono sottoinsiemi di cellule T CD4 +. Le cellule T reg svolgono un ruolo cruciale nella tolleranza immunitaria e manutenzione omeostasi dalla regolazione della risposta immunitaria. Il ruolo primario delle cellule T reg è di sopprimere la proliferazione delle cellule T effettrici (T eff) e la produzione di citochine, quali IFN-γ, TNF-α e IL-2. È stato dimostrato che la capacità delle cellule T reg di inibire la funzione delle cellule T eff è migliorata durante l'infezione patogeno persistente e lo sviluppo del cancro. Per chiarire la funzione delle cellule T reg in condizioni di riposo o infiammate, una varietà di saggi in vitro soppressione utilizzando cellule reg topo o T umana sono stati ideati. L'obiettivo principale di questo studio è quello di sviluppare un metodo per confrontare le differenze di fenotipo e la funzione soppressiva tra riposo e reg T attivatecellule. Per isolare le cellule T attivate reg, i topi sono stati infettati con il virus linfocitica choriomeningitis (LCMV) clone 13 (CL13), un ceppo cronica di LCMV. Le cellule T reg isolate dalla milza di topi LCMV CL13-infettati esposti sia il fenotipo attivato e l'attività soppressiva maggiore rispetto a riposo cellule T reg isolate da topi naive. Qui, descriviamo il protocollo di base per l'analisi ex vivo fenotipo di distinguere le cellule T attivate reg dal riposo cellule T reg. Inoltre, si descrive un protocollo per la misurazione dell'attività soppressiva di cellule T reg pienamente attivato.
Introduzione
T regolatorie (T reg) cellule esprimono scatola forkhead P3 (Foxp3) come un fattore di trascrizione per il loro sviluppo e la funzione 1. Inoltre, le cellule reg T esprimono varie altre molecole come CD25 2, gene linfociti-attivazione 3 (GAL-3) 3, indotta da glucocorticoidi tumor necrosis factor receptor 4, e linfociti T citotossici-proteina associata 4 (CTLA-4) 5 sulla loro superficie o regione intracellulare. Durante l'infezione cronica con vari tipi di agenti patogeni come virus, batteri 6,7 8,9 e parassiti 10-12, o in corso di sviluppo del cancro
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Protocollo
In questo studio, i topi sono stati mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni della Yonsei Laboratory Animal Research Center della Yonsei University. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida Korean Food and Drug Administration utilizzando protocolli approvati dal Comitato Internazionale cura degli animali e uso del centro Animal Research Laboratory presso Yonsei Yonsei University.
1. preparazione di soluzioni
- Preparare 2% RPMI mezzi diluendo siero bovino fetale (FBS) al 2% e la penicillina-streptomicina al 1% in RPMI
- Preparare i media RPMI completo. P....
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Risultati
Abbiamo generato topi con infezione da virus persistente, iniettando loro con 2 x 10 6 pfu di LCMV CL13 per via endovenosa. Per studiare i cambiamenti fenotipici nelle cellule T reg e le cellule T conv durante l'infezione cronica da virus, linfociti splenici ottenuti da topi naive e infetti sono state colorate con vari anticorpi e analizzati mediante citometria di flusso. A 16 anni d PI, PD-1 è stato upregulated in entrambi Foxp3 - T CD4
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Discussione
Anche se solo un piccolo numero di cellule T reg esiste nei topi e nell'uomo, è importante capire la loro funzione come giocano un ruolo cruciale nella regolazione della risposta immunitaria e mantenimento della tolleranza immunitaria. Le funzioni di numeri e soppressive di T reg cellule aumenta nel corso di una infezione da virus cronica 15-20 così come la progressione del cancro 13,14. Questo è probabilmente dovuto alla stimolazione antigenica continua. Per valutare l.......
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Dichiarazioni
S.-J.H. ha un brevetto e riceve royalties relative al percorso PD-1. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Scientifica di Base attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione (2015R1A6A3A01020610 a HJP) e da una sovvenzione del Progetto di Ricerca e Sviluppo di Tecnologia Sanitaria Coreana, Ministero della Salute, del Welfare e degli Affari Familiari, Repubblica di Corea (HI15C0493 a SJH).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | |
| Piastre per colture tissutali U-Bottom BD | Biosciences | 353077 | |
| Tampone | BD Biosciences 554655 | ||
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 |
| Filtro cellulare, 70 mm | BD Biosciences | 352350 | |
| Filtro cellulare, 40 mm | BD Biosciences | 352340 | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 |
| di tamponi per colorazione Foxp3/fattore di trascrizione | eBioscience | 00-5223 | |
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | |
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | |
| PBS (1x) | GE Life Sciences | SH30256 | |
| tampone | Gibco | A10492-01 | |
| L-glutammina, soluzione da 200 mM | Gibco | Codice 25030 | |
| Penicillina-Streptomicina, 10.000 U/ml | Gibco | Codice 10378-016 | |
| colorazione delle cellule morte nel vicino infrarosso fissabile LIVE/DEAD | technologies | L-34975 | |
| CD8a+ Kit di isolamento delle cellule T, topo | Miltenyibiotec | 130-104-075 | |
| CD4+ CD25+ Kit di isolamento delle cellule T regolatorie, topo | Miltenyibiotec | 130-091-041 | |
| Colonne di separazione MACS, colonne | LDMiltenyibiotec | 130-042-901 | |
| Colonne di separazione MACS, colonne | Miltenyibiotec | 130-042-401 | |
| EDTA, 0,5 M (pH 8,0) | Promega | V4231 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma Life Science | M7522 | |
| Siero | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | |
| CellTrace Kit | di proliferazione cellulare viola | Termo Fisher Scientific | C34557 |
| BD Canto II flussocitometro | BD Biosciences | ||
| Flowjo | TreeStar | ||
| Ematocitometro | Marienfeld superiore |
Riferimenti
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M.
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Ristampe e permessi
