Summary

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

Published: July 24, 2016
doi:

Summary

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Abstract

במחקר על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה היא קריטית. הראשון מבין שני מסלולי זיהומיות העיקריים למוח הוא הדרך hematogenous, הכוללת זיהום של תאי האנדותל pericytes של המוח. השני הוא intracerebroventricular המסלול (ICV). לאחר מכן, בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), וירוסים עלולים להתפשט בחלל תת-העכבישים, קרומי המוח, ואת המקלעת דמתה עין באמצעות נוזל השדרה. במודלים ניסיוניים, בשלבים המוקדמים של ההפצה ויראלית CNS אינם מתאפיינים גם, ולא ברור אם תאים מסוימים רק בתחילה נגועים. הנה, יש לנו ניתחו את חלוקת ציטומגלווירוס (CMV) חלקיקים בשלב החריף של זיהום, כינה viremia העיקרי, בעקבות ICV או intravascular (IV) הזרקה לתוך המוח עכבר בילוד. במודל הזרקת ICV, 5 μl של murine CMV (MCMV) או microbeads פלורסנט הוזרקו החדר לרוחב בבית midpoiNT בין העין לאוזן באמצעות מזרק 10 μl עם מחט 27 G. במודל הזרקה IV, מזרק 1 מ"ל עם מחט 35 G היה בשימוש. Transilluminator שמש כדי להמחיש את הווריד (פנים) הזמני השטחי של העכבר בילוד. אנו חדורים 50 μl של MCMV או microbeads פלורסנט לווריד הזמני השטחי. המוח נקצרו בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה. הגנום MCMV התגלו באמצעות שיטת הכלאה באתרו. microbeads פלורסנט או חלבון פלואורסצנטי ירוק להביע חלקיקי MCMV רקומביננטי נצפה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקות אלה ניתן ליישם פתוגנים רבים אחרים לחקור בפתוגנזה של דלקת קרום המוח.

Introduction

כאשר לומדים אנצפליטיס ויראלי, חלוקת הראשונית של חלקיקים נגיפיים מאוד חשוב להבין בהיווצרות המחלה ולזהות מטרות ויראלי במוח. רוב הווירוסים טווח בגודל מ 20 כדי 300 ננומטר, למרות Pandoravirus הוא יותר מ -700 ננומטר בגודל 1. התפלגות החלקיקים הנגיפיים בשלב החריף של זיהום עלולה תלוי בגודל של החלקיקים, החלוקה קולטנית תאים, או הזיקה של קולטני התאים לאיתור וירוסים. במודלים של בעלי חיים, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, שליה ישיר, ו תוך ורידי (IV) זיהומים שימשו ללמוד בפתוגנזה של דלקת המוח ויראלית. חיסון עם וירוס ICV משמש לעתים קרובות כדי להקים מערכת העצבים המרכזית (CNS) זיהומים בעכברים. מחקרים שעשה שימוש בטכניקה זו לדווח זיהום נפוץ, במיוחד של תאי אזורי periventricular וב האזורים במוח בקשר ישיר עם הנוזל השדרתי (CSF), similar להשפעות של ventriculoencephalitis ויראלי. גודלו הקטן של וירוס adeno הקשורים (AAV) חלקיקים (20 – 25 ננומטר בקוטר) הופך לפשוט תפוצתם בכל חלקי המוח זיהומים ICV 2-4. Intraperitoneal 5, שלית 6 ישירה, וזריקות IV 7 לייצג ממשל מערכתי hematogenic. חדירת חלקיקים נגיפיים דרך מחסום הדם-מוח (BBB) ​​מאפשר להם להגיע parenchyma של המוח בילוד, המייצג גושים microglial מפוזר 8,9.

ציטומגלווירוס (CMV) הוא וירוס נפוץ שייך למשפחת וירוס ההרפס. בארצות הברית, 50% – 80% מהאנשים היו זיהום CMV לפי גיל 40. זיהומי CMV הם לעתים רחוקות מזיקים אבל יכולים לגרום למחלות בחולים ועוברים מדוכאי חיסון. מכלל הלידות, 0.2% – 2% נולדים עם CMV 10, וכתוצאה מכך תופעות חמורות כגון מיקרוצפליה, הסתיידות periventricular, hypoplasia המוח הקטן, micrדלקת העין, ואת עצב הראייה ניוון 11,12. יתר על כן, פיגור שכלי, איבוד שמיעה עצבי, פגמים חזותיים, התקף, אפילפסיה להתרחש כ -10% של אי-אנושות תינוקות CMV נגוע 13,14. תפקוד לקוי של מערכת העצבים המרכזית היא סימפטום אופייני הנפוצים ביותר של האנומליה המולדת CMV. עוד ילדים הם נכים לכל החיים בכל שנה על ידי CMV מולד מאשר תסמונת דאון, תסמונת אלכוהול עוברית, או ספינה ביפידה 15. אין חיסון נגד CMV זמין על ההווה, קוראת צורך של חיסון בטוח ויעיל. לימוד האינטראקציה של חלקיקי CMV עם קולטנים שלהם בשלב המוקדם של זיהום חשוב להבין את ההשפעה של החיסון.

Ventriculoencephalitis גושים microglial מפוזר הם שני מאפיינים פתולוגיים הראשי של CMV דלקת המוח 16. זה כבר לא ברור כיצד חלקיקי CMV (150 – 300 ננומטר) להפיץ דרך המוח בשלב החריף של זיהוםnd איך חלוקת קולטנים הסלולר זיקתם וירוסים תורמים להתפשטות ויראלית. קוואסאקי et al. הערך ICV ו- IV זיהומים מנקודת המבט של ההפצה של חלקיקים הקולטנים שלהם (integrin β1) בשלב המוקדם של זיהום. מצאנו כי הפצת חלקיקי CMV ואת הביטוי של integrin β1 מתואמת היטב בשלב המוקדם של זיהום בשני ICV ו- IV זיהומי 8. זיהום ICV הוא מודל של ventriculoencephalitis וזיהום IV הוא מודל של גושי microglial מפוזרים. לימוד הדינמיקה של חלקיקים נגיפיים או פלורסנט ייתן מידע שימושי על השפעת גודל החלקיקים, אינטראקציות ויראלי עם קולטני התאים, ואת מנגנון החדירה BBB במוח. הפרוטוקול הבא יכול לשמש כדי לחקור כל זיהום ויראלי וקטור ויראלי של מערכת העצבים המרכזי.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של Hamamatsu אוניברסיטת בית הספר לרפואה. 1. הכנת MCMV (זן סמית) ו רקומביננטי M32 משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) -MCMV צור רקומביננטי M…

Representative Results

במחקרים על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה חשובה. מסלול hematogenous מייצג זיהום חריף של תאי האנדותל pericytes של המוח, בעוד מסלול ICV מייצג זיהום חריף מתפשט דרך CSF בחלל תת-העכבישים, מגיע עד קרומי המוח ואת המקלעת דמתה. כדי לנתח את ההתפלגות הראשונה של חלק…

Discussion

במודלים של בעלי חיים, ICV, intraperitoneal, שליה ישירה, וזיהומי IV שמש ללמוד בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית. התמקדנו דגמי ICV ו- IV הזרקה של עכברים בילוד עבור הפשטות של הנהלים לטובת הזרקה ישירה של חלקיקים לתוך אזור היעד. למרות זיהום intraperitoneal הוא שיטה קלה, חלקיקים נגיפיים להפיץ מערכתי ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

Materials

Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane Sigma-Aldrich T-6791
HCl Sigma-Aldrich H-1758
pEGFP-N1 vector  Clontech #6085-1
D-sorbitol Sigma-Aldrich S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 Spherotech, Inc. FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 Spherotech, Inc. FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 Spherotech, inc.  FP-2056-2
10% mouse serum DAKO  X0910
C57BL/6 mouse SLC, Inc.
ICR mouse SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series) Hamilton company
35-gauge needle Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator Phillips Healthcare 1017920
O.C.T.Compound Sakura Finetek 4583
RNase A Sigma-Aldrich R4642
Nonidet(R) P-40 Nacalai 25223-04
citrate buffer (pH6) x10 Sigma-Aldrich C9999-100ml
pepsin Sigma-Aldrich P6887
EDTA dojindo N001
Formamide TCI F0045
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich 42867-5G
Denhardt's Solution (50X) ThermoFishcer sceintific 750018
Yeast tRNA (10 mg/mL) ThermoFishcer sceintific AM7119
SSC x20 Sigma-Aldrich S6639
DAPI ThermoFishcer sceintific D1306
n-Hexane Sigma-Aldrich 296090
superfrost plus glass ThermoFishcer sceintific 12-55-18
Cytokeep II Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 Vector laboratories, Inc. L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE ebioscience 12-0311
ProLong  Gold ThermoFishcer sceintific P36934
BIOREVO KEYENCE BZ-9000E

Riferimenti

  1. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  2. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
  3. Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  4. McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
  5. Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
  6. Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
  8. Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
  9. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
  10. Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
  11. Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
  12. Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
  13. Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
  14. Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
  15. Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
  16. Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
  17. Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
  18. Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
  19. Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
  22. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
  23. Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
  24. Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
  25. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
  26. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Kawasaki, H., Kosugi, I., Sakao-Suzuki, M., Meguro, S., Tsutsui, Y., Iwashita, T. Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain. J. Vis. Exp. (113), e54164, doi:10.3791/54164 (2016).

View Video