Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
I studien på patogenesen av viral encefalit, är infektionen metoden kritisk. Den första av de två viktigaste infektionsvägar till hjärnan är den hematogen väg, som innebär infektion av endotelceller och pericyter i hjärnan. Den andra är den intracerebroventrikulära (ICV) vägen. Väl inne i centrala nervsystemet (CNS), kan virus sprids till subaraknoidalrummet, hjärnhinnorna, och choroid plexus via cerebrospinalvätskan. I experimentella modeller, är de tidigaste stadierna av CNS viral spridning inte väl karakteriserade, och det är oklart om endast vissa celler initialt infekterade. Här har vi analyserat fördelningen av cytomegalovirus (CMV) partiklar under den akuta fasen av infektion, kallas primär viremi efter ICV eller intravaskulärt (IV) injektion i neonatal mushjärna. I ICV injektion modell, var 5 pl mus CMV (MCMV) eller fluorescerande mikropärlor injiceras i den laterala ventrikeln vid midpoint mellan örat och ögat med en 10-il spruta med en 27 G nål. I IV injektion modellen gjordes en 1-ml spruta med en 35 G nål används. En transilluminator användes för att visualisera ytliga temporala (ansiktet) ven neonatal mus. Vi infunderas 50 pl MCMV eller fluorescerande mikrokulor i den ytliga temporala ven. Hjärnor skördades vid olika tidpunkter efter injektion. MCMV genomen upptäcktes med hjälp av in situ hybridisering metod. Fluorescerande mikropärlor eller grönt fluorescerande protein som uttrycker rekombinanta MCMV partiklar observerades genom fluorescensmikroskopi. Dessa tekniker kan appliceras på många andra patogener för att undersöka patogenesen av encefalit.
När man studerar viral encefalit, är den ursprungliga distributionen av viruspartiklar mycket viktigt att förstå sjukdomen patogenes och identifiera virala mål i hjärnan. De flesta virus varierar i storlek från 20 till 300 nm, även om Pandoravirus är mer än 700 nm i storlek 1. Fördelningen av de virala partiklarna i den akuta fasen av infektion kan bero på storleken av partiklarna, fördelningen av cellulära receptorer, eller affiniteten av de cellulära receptorer för virus. I djurmodeller, intracerebroventrikulär (ICV), intraperitoneala, direkt placenta, och intravenös (IV) infektioner har använts för att studera patogenesen av viral encefalit. ICV ympning med virus används ofta för att fastställa centrala nervsystemet (CNS) infektioner hos möss. Studier som använder denna teknik rapportera utbredd infektion, särskilt av celler i periventrikulära zonerna och i områden av hjärnan i direkt kontakt med cerebrospinalvätska (CSF), Similar att effekterna av virus ventriculoencephalitis. Den lilla storleken av adenoassocierat virus (AAV) partiklar (20-25 nm i diameter) underlättar spridning i hela hjärnan i ICV infektioner 2-4. Intraperitoneala 5, direkt placenta 6, och IV injektioner 7 representerar hematogenic systemisk administration. Penetrationen av virala partiklar genom blod-hjärnbarriären (BBB) tillåter dem att nå den parenkymet av den neonatal hjärna, som representerar diffusa mikrogliaceller knutor 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) är ett vanligt virus som tillhör herpesvirusfamiljen. I USA, 50% – har 80% av de människor hade CMV-infektion efter ålder 40. CMV-infektioner sällan skadligt, men kan orsaka sjukdomar hos patienter med nedsatt immunförsvar och foster. Av alla förlossningar, 0,2% – är 2% föds med CMV 10, vilket resulterar i allvarliga symtom som mikrocefali, periventrikulär förkalkning, cerebellär hypoplasi, microphthalmia och synnerven atrofi 11,12. Dessutom mental retardation, sensorineural hörselnedsättning, synfel, beslag, och epilepsi förekommer i cirka 10% av icke-dödligt CMV-infekterade spädbarn 13,14. CNS dysfunktion är den vanligaste karakteristiska symptom på CMV medfödd anomali. Fler barn är permanent inaktiv varje år av medfödd CMV än av Downs syndrom, fetalt alkoholsyndrom, eller ryggmärgsbråck 15. Det finns inga vaccinationer mot CMV finns för närvarande, kräver ett behov av ett säkert och effektivt vaccin. Studera interaktionen av CMV-partiklar med deras receptorer i den tidigaste fasen av infektion är viktigt att förstå effekten av vaccinationen.
Ventriculoencephalitis och diffusa microglial knölar är de två viktigaste patologiska egenskaperna hos CMV encefalit 16. Det har varit oklart hur CMV partiklar (150-300 nm) sprids genom hjärnan i den akuta fasen av infektion ennd hur fördelningen av cellulära receptorer och deras affinitet för virus bidrar till viral spridning. Kawasaki et al. Har utvärderat ICV och IV infektioner från perspektivet av fördelningen av partiklar och deras receptorer (β1 integrin) i den tidigaste fasen av infektion. Vi har funnit att spridningen av CMV partiklar och uttrycket av β1 integrin är väl korrelerade i den tidigaste fasen av infektion hos både ICV och IV-infektioner 8. ICV-infektion är en modell av ventriculoencephalitis och IV-infektion är en modell av diffusa mikrogliaceller knölar. Studera dynamiken i virala eller fluorescerande partiklar skulle ge användbar information om effekten av partikelstorleken, virala interaktioner med cellulära receptorer, och mekanismen för BBB penetration i hjärnan. Följande protokoll kan användas för att undersöka varje virusinfektion och virusvektor i CNS.
I djurmodeller, ICV, intraperitoneal, direkt placental och IV infektioner har använts för att studera patogenesen av viral encefalit. Vi fokuserade på de ICV och IV injektion modeller av neonatala möss för enkelheten av de förfaranden och nyttan av direkt injektion av partiklar in i målregionen. Även intraperitoneal infektion är en enkel metod, viruspartiklar sprids systemiskt via en indirekt process 5,24. Direkt placental infektion är en bra metod för att studera embryonala systemisk infektion. De…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
ICR mouse | SLC, Inc. | ||
Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
35-gauge needle | Saito Medical | ||
A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
EDTA | dojindo | N001 | |
Formamide | TCI | F0045 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |