JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия

Published: July 09, 2016
doi:
10.3791/54214
, , , , ,
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Summary

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Abstract

Человеческий мозг является высокое потребление энергии орган, который в основном опирается на глюкозу в качестве источника топлива. Глюкоза катаболизируется митохондрий мозга с помощью гликолиза, пути три-карбоновой кислоты (ТСА) цикл и окислительного фосфорилирования (OXPHOS) для получения клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Нарушение митохондриальной АТФ вызывает митохондриальных нарушений, которые представляют клинически с видными неврологическими и миопатии симптомов. Митохондриальные дефекты также присутствуют в неврологическими расстройствами (например , расстройства спектра аутизма) и нейродегенеративных расстройств (например , боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера и болезни Паркинсона). Таким образом, существует повышенный интерес к области для проведения 3D анализа митохондриальной морфологии, структуры и распределения в рамках обоих здоровых и болезненных состояний. Мозг митохондриальная морфологии чрезвычайно разнообразны, с некоторыми митохондрии особенно всинаптической области находится в диапазоне от <диаметром 200 нм, что ниже предела разрешения традиционной световой микроскопии. Выражая митохондрии нацеленную зеленый флуоресцентный белок (GFP) в головном мозге значительно повышает органоидного обнаружение с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, оно не устраняет ограничения на чувствительность обнаружения относительно небольших размеров митохондрий без oversaturating образы больших размеров митохондрий. В то время как последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для описания митохондрии на нейронном синапсе, этот метод очень много времени, особенно при сравнении нескольких образцов. Метод последовательного блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) включает в себя автоматизированный процесс секционирования, блоки формирования изображения ткани и сбора данных. Здесь мы приводим протокол для выполнения SBFSEM из определенной области от мозга грызуна быстро реконструировать и визуализировать митохондриальной морфологии. Эта технологияNique также может быть использован для обеспечения точной информации о митохондриальной номер, объем, размер и распределение в определенной области мозга. Так как полученное разрешение изображения высокое (как правило, до 10 нм), также могут быть обнаружены какие-либо грубые митохондриальные морфологические дефекты.

Introduction

Митохондрии являются динамическими органеллы , которые изменяют свою форму и расположение в зависимости от сотовой связи киев и потребностей, в тесном взаимодействии с цитоскелета клетки, и в ответ на клеточных событий , таких как токи кальция в нейронах 1. Митохондрии также взаимодействовать с другими клеточные органеллы , например , эндоплазматический ретикулум, что , в свою очередь , регулирует их динамику и метаболизм 2. Митохондриальная морфология показывает гетерогенность в различных типах клеток т.е.. форма органеллы изменяется от трубчатой ​​до , что состоящие из листов, мешков и овалы 3. Было показано , что митохондриальные синтеза и деления белков цикл может регулировать местоположение, размер, форма и распределение митохондрий 4. Более того, изменения в митохондриальной формы связаны с нейродегенерации, нейрональной пластичности, мышечной атрофии, кальциевой сигнализации, генерации активных форм кислорода, а также продолжительность жизни и гибели клеток вовлекая тхаТ – клеток специфических митохондриальная морфологии имеет решающее значение для поддержания нормальной клеточной функции 5-11.

Одна из основных биоэнергетической функция митохондрий является создание аденозинтрифосфата (АТФ), выполнив ряд метаболических реакций , которые включают полный распад питательных веществ (т.е. глюкоза, жирные кислоты или амино-кислоты) через ЦТК и OXPHOS путей 12. Человеческий мозг составляет лишь 2% от массы тела , однако он потребляет ~ 20% от общего объема произведенной энергии делает его чрезвычайно энергию с требованием органа 13. Поэтому не удивительно , что митохондриальной дисфункцией у человека приводит к большому числу неврологических проявлений 14-17 лет. Генетические мутации в компонентах OXPHOS , которые ослабляют приводит АТФ поколения к митохондриальных нарушений 17,18, которые клинически гетерогенную группу расстройств с преобладанием ~ 1: 5000 человек, и одна из наиболее распространенных причин мetabolic расстройства у детей и взрослых. Дефицит митохондрии происхождения АТФ влияет на несколько органов и систем с требовательными органов высоких энергий , таких как мозг, сердце и скелетных мышц будучи преимущественно затронуты в этих больных 14,17,18. В последние годы, несколько исследований были получены данные для митохондриальной дисфункции у обоих неврологическими и нейродегенеративные расстройства 15-17,19,20. Поскольку митохондрии являются существенными и решающее значение для развития и функционирования мозга, что необходимо разработать протоколы, которые могут анализировать изменения мозга митохондриальной морфологии, структуры, размера, количества и распределения по обоим здоровых и больных состояний. Мышиные модели с митохондриях-целевой зеленого флуоресцентного белка (GFP) были произведены для визуализации митохондриальные движения и локализации в головном мозге 21,22. Хотя это является чрезвычайно полезным инструментом для изучения митохондриальной моторику и общее распределение, есть некоторые недостатки, которые входите ограниченное разрешение и чувствительность флуоресцентной микроскопии. Эти свойства делают его трудно отследить относительно небольшие митохондрии размера. Аналогичным образом , последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для просмотра синаптическую митохондрии 23, но этот метод очень много времени. Митохондриальная морфология , как известно, весьма динамично , как они проходят непрерывные деления и термоядерных циклов, и в большинстве клеток митохондрии поддерживать высокосвязных сети 24-26. Нейроны высоко поляризованные клетки с множественными дендритов и аксонов, протяженных и митохондрий , которые образуют соединение с сетью сетчатую в теле клетки , возможно , придется разделить , как они делают свой ​​путь через эти невриты (рис 1). Это делает митохондрии мозга весьма разнообразные по форме и размеру. Например, с помощью последовательного блок-слойного сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) метод, ранее мы наблюдали, что разница в объеме или размер внесинаптического mitochondrIA в митохондриях , присутствующих в нервных окончаниях , может быть столько , сколько шестнадцать сгиб 27.

Есть несколько подходов к проведению анализа объема 28, который включает в себя последовательный раздел TEM 29, автоматизированная лента сбора ультрамикротоме SEM 30, сфокусированный пучок ионов SEM 31 и SBFSEM 32. Анализ SBFSEM имеет преимущества в том, что она имеет разрешение предоставлять количественные данные о морфологической формы, размера, распределения и числа органелл, таких как митохондрии в районах до 1 мм мозга. Техническая операция также наименее требовательным, с сбора и анализа данных в рамках возможностей многих биологических лабораторий, которые испытывают недостаток предыдущего опыта EM. Появление коммерческих инструментов для создания последовательных секций подобные изображения сделал 3D ультраструктурную анализ тканей рутинной техникой, которая дополнительно позволяет непредвзятый анализ объемный в быстрой и повторяемым способом 28 </SUP>. SBFSEM была впервые описана и используется в области нейробиологии в 2004 году 32, основанный на идее , введенной Лейтона в 1981 году 33. Несколько исследований с тех пор установили эту технику в качестве основного инструмента при анализе реконструкции нейронной цепи 34. Кроме того, для многих небольших масштабных проектов, обеспечивает анализ реконструкции для выявления клеточных органелл 27,35-39. Так, приобретенные изображения являются производными от низкого напряжения обратного рассеяния электронов, были разработаны новые протоколы окрашивания , которые сочетают в себе различные известные методы окраски тяжелых металлов , чтобы увеличить разрешение 40.

В этой статье мы приводим протокол для использования 3D электронной микроскопии и обработки изображений объемный анализ митохондрий мозга , основанный на методах, которые ранее были использованы нами и другими 38,39,41. Методы ткани после обработки , используемые были , как описано ранее Deerinck и др40.

Protocol

Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) в Вирджинии с. Внимание: Экстремальные меры предосторожности следует соблюдать осторожность при обращении и утилизации нескольких компонентов, используемых в данном протокол?…

Representative Results

Показано, что мозг митохондриальная морфологии и размера неоднородна в различных нейрональных подразделам отсеков. Конфокальной микроскопии на низкой плотности нейрональных культур трансдуцированных с лентивирусов выражения митохондрии нацеленную зеленый флуор?…

Discussion

Сложность нервной системы представляет собой значительную проблему в реконструкции больших объемов тканей и анализа морфологии и распределения органелл, таких как митохондрии с достаточным разрешением. Несколько клеток включая нейроны, олигодендроциты и астроциты с многочисленным…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Materials

C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson’s and Alzheimer’s disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd, V. A., Bohr, Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Brain MitochondriaSerial Block-face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial MorphologyNeurodegenerative DisordersNeurodevelopmental DisordersSample PreparationStainingDehydrationEmbedding
check_url/54214?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image