Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido
Summary
Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Abstract
El cerebro humano es un órgano de alto consumo de energía que se basa principalmente en la glucosa como fuente de combustible. La glucosa se cataboliza por las mitocondrias cerebrales a través de la glucólisis, las vías de ciclo y la fosforilación oxidativa de ácido tri-carboxílico (TCA) (fosforilación oxidativa) para producir la energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP). Deterioro del valor de la producción de ATP mitocondrial causa los trastornos mitocondriales, que presentan clínicamente con síntomas neurológicos y myopathic prominentes. Defectos mitocondriales también están presentes en los trastornos del neurodesarrollo (por ejemplo, trastorno del espectro autista) y trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson). Por lo tanto, hay un aumento de interés en el campo para la realización de análisis en 3D de mitocondrial morfología, estructura y distribución bajo ambos estados sanos y enfermedades. La morfología mitocondrial cerebro es extremadamente diverso, con algunas mitocondrias especialmente los dela región sináptica en el intervalo de <200 nm de diámetro, que está por debajo del límite de resolución de la microscopía de luz tradicional. Expresar una proteína orientado mitocondrialmente-verde fluorescente (GFP) en el cerebro mejora significativamente la detección organellar por microscopía confocal. Sin embargo, no supera las limitaciones de la sensibilidad de detección de relativamente pequeñas mitocondrias de tamaño sin oversaturating las imágenes de gran tamaño mitocondrias. Mientras microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para caracterizar las mitocondrias en la sinapsis neuronal, esta técnica es extremadamente lento especialmente cuando se comparan múltiples muestras. La técnica de bloqueo cara microscopía electrónica de barrido de serie (SBFSEM) implica un proceso automatizado de seccionamiento, bloques de imagen de adquisición de datos y el tejido. A continuación, ofrecemos un protocolo para realizar SBFSEM de una región definida del cerebro de roedores para reconstruir y visualizar la morfología mitocondrial rápidamente. esta tecnologíanique también podría ser utilizado para proporcionar información precisa sobre el número mitocondrial, volumen, tamaño y distribución en una región del cerebro definido. Dado que la resolución de la imagen obtenida es alta (típicamente bajo 10 nm) también se pueden detectar los defectos morfológicos mitocondriales brutos.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos dinámicos que cambian su forma y ubicación en función de las señales y las necesidades celulares, en la interacción estrecha con el citoesqueleto celular, y en respuesta a eventos celulares tales como las corrientes de calcio en las neuronas 1. Las mitocondrias también interactúan con otros orgánulos celulares, por ejemplo, retículo endoplásmico, que a su vez regula el metabolismo de su dinámica y 2. Morfología mitocondrial muestra heterogeneidad en diferentes tipos de células, es decir. la forma de la orgánulo varía de tubular a la que consiste en hojas, sacos y óvalos 3. Se ha demostrado que la fusión y de fisión proteínas del ciclo mitocondriales pueden regular la ubicación, tamaño, forma y distribución de las mitocondrias 4. Además, cambios en la forma mitocondrial se asocian con la neurodegeneración, la plasticidad neuronal, la atrofia muscular, la señalización de calcio, la generación de especies reactivas del oxígeno, así como la vida útil y la muerte celular que implican a thala morfología mitocondrial de células T específica es crítico para el mantenimiento de la función celular normal 5-11.
Una importante función bioenergética de la mitocondria es la generación de trifosfato de adenosina (ATP) mediante la ejecución de una serie de reacciones metabólicas que implican ruptura completa de nutrientes (es decir, glucosa, grasos de ácidos o aminoácidos) a través del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa vías 12. El cerebro humano constituye sólo el 2% del peso corporal sin embargo, consume ~ 20% de la energía total producida por lo que es extremadamente demandante de energía de órganos 13. Por lo tanto, no es sorprendente que la disfunción mitocondrial en los seres humanos conduce a un gran número de manifestaciones neurológicas 14-17. Las mutaciones genéticas en los componentes de la fosforilación oxidativa que impiden la generación de ATP conduce a trastornos mitocondriales 17,18, que son clínicamente grupo heterogéneo de enfermedades con una prevalencia de 1: ~ 5.000 personas, y una de las causas más comunes de mtrastornos etabolic en niños y adultos. Déficit de ATP mitocondrias derivadas afecta a múltiples sistemas de órganos con órganos que demandan alta energía, como el cerebro, el corazón y los músculos esqueléticos están predominantemente afectados en estos pacientes 14,17,18. En los últimos años, varios estudios han proporcionado evidencia de disfunción mitocondrial en ambos trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos 15-17,19,20. Dado que las mitocondrias son esenciales y fundamentales para el desarrollo y función del cerebro, es imperativo desarrollar protocolos que pueden analizar los cambios en el cerebro mitocondrial morfología, estructura, tamaño, número y distribución previstos en ambos estados sanos y enfermos. Los modelos de ratones con la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente (GFP) se han producido para visualizar los movimientos mitocondriales y localización en el cerebro 21,22. Si bien esta es una herramienta extremadamente útil para examinar la motilidad mitocondrial y la distribución general, hay algunos inconvenientes que Includresolución limitada e y la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia. Estos atributos hacen que sea difícil realizar un seguimiento de las mitocondrias relativamente pequeñas de tamaño. Del mismo modo, la microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para ver mitocondrias sináptica 23, pero este método es mucho tiempo. Morfología mitocondrial es conocido por ser altamente dinámico ya que se someten a ciclos continuos de fusión y de fisión, y en la mayoría de las células de la mitocondria mantener una red altamente conectado 24-26. Las neuronas son células con múltiples dendritas y axones extendidas, y las mitocondrias que forman una red reticular conectado en el cuerpo de la célula altamente polarizada puede tener que separar ya que hacen su camino a través de estos axones (Figura 1). Esto hace que las mitocondrias cerebrales extremadamente variadas en tamaño y forma. Por ejemplo, utilizando el bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie técnica (SBFSEM), se observó previamente que la diferencia en el volumen o tamaño de mitochondr extrasynapticia a las mitocondrias presentes en los terminales de los nervios puede ser tanto como dieciséis pliegan 27.
Existen varios enfoques para la realización de los análisis del volumen 28, que incluye la sección de serie TEM 29, la cinta automatizadas para la recolección ultramicrotomo SEM 30, se centró haz de iones SEM 31 y 32 SBFSEM. El análisis SBFSEM tiene ventajas en que tiene la resolución para proporcionar datos cuantitativos sobre la forma morfológica, el tamaño, la distribución y el número de orgánulos tales como mitocondrias en áreas de hasta 1 mm del cerebro. La operación técnica es también la menos exigente, con la adquisición de datos y análisis dentro de las capacidades de muchos laboratorios biológicos que carecen de experiencia previa EM. El advenimiento de los instrumentos comerciales para la generación de la sección similar a imágenes en serie ha hecho 3D análisis ultraestructural de los tejidos de una técnica de rutina, que permite, además, un análisis volumétrico imparcial de una manera rápida y repetible 28 </sup>. El SBFSEM fue descrita por primera vez y se utiliza en el campo de la neurobiología en 2004 32, basado en una idea introducida por Leighton en 1981 33. Múltiples estudios han establecido desde entonces esta técnica como una herramienta importante en el análisis de la reconstrucción de los circuitos neuronales 34. Además, para muchos proyectos de menor escala, se proporciona un análisis para identificar la reconstrucción orgánulos celulares 27,35-39. Puesto que, las imágenes adquiridas se derivan de baja tensión electrones retrodispersión, nuevos protocolos de tinción que se combinan diferentes técnicas conocidas de tinción de metales pesados fueron desarrollados para aumentar la resolución 40.
En este trabajo, ofrecemos un protocolo para la utilización de imágenes de microscopía electrónica 3D y el análisis volumétrico de las mitocondrias del cerebro sobre la base de métodos que han sido previamente utilizados por nosotros y otros 38,39,41. Los métodos de post-procesamiento de los tejidos utilizados fueron como se ha descrito anteriormente por Deerinck y col40.
Protocol
Representative Results
Discussion
La complejidad del sistema nervioso plantea un reto importante en la reconstrucción de volúmenes de tejido grandes y el análisis de la morfología y distribución de los orgánulos tales como mitocondrias con una resolución adecuada. Varias células, incluyendo neuronas, oligodendrocitos y astrocitos con numerosos procesos extendidos en tres dimensiones interactúan dentro del tejido cerebral 43. Dado que las mitocondrias reside tanto en el soma de las células y los procesos distantes, la morfología mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
References
- Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
- Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
- Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
- Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
- Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson’s and Alzheimer’s disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
- Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
- Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
- Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd, V. A., Bohr, Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
- Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
- Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
- Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
- Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
- Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
- Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
- Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
- Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
- Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
- Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
- Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
- Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
- Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
- Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
- Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
- Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
- Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).
