تقنيات لتطور قوية خميرة تخمر البنتوز للالتحويل البيولوجي من مادة الخشب إلى إيثانول
Summary
ووصف تقنيات التطور والعزلة على التكيف وأظهرت لانتاج مشتقات سلالة Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 التي تكون قادرة على تستهلك بسرعة هيكسوز والسكريات مختلطة البنتوز في انزيم saccharified hydrolyzates undetoxified وتتراكم أكثر من 40 جم / لتر من الإيثانول.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
على 1.3 مليار طن الجافة السنوية المقدرة من الكتلة الحيوية lignocellulosic أن تدعم إنتاج الإيثانول والسماح للولايات المتحدة للحد من استهلاك النفطية بنسبة 30٪. 1 على الرغم من أن محطة الكتلة الحيوية خليط عوائد التحلل السكر الغنية في الجلوكوز والفركتوز، يتم إنشاء مثبطات انزيم من المعالجة الكيميائية اللازمة لكسر هيميسيلولوز وفضح السليلوز لهجوم الأنزيمية. ويعتقد أن حمض الخليك، فورفورال، وهيدروكسي (HMF) أن تكون المكونات الرئيسية بين العديد من المثبطات التي تشكل أثناء المعالجة. من أجل المضي صناعة الإيثانول lignocellulosic إلى الأمام، والبحوث وإجراءات للسماح للتطور سلالات الخميرة قادرة على قيد الحياة وتعمل على استخدام كل هيكسوز والسكريات البنتوز في وجود هذه المركبات المثبطة هناك حاجة بكفاءة. وضعف إضافي كبير من سلالات الخميرة الصناعية التقليدية، مثل خميرة الخباز، هو عدم القدرة على fermen بكفاءةر زيلوز متاح في hydrolyzates من الكتلة الحيوية النباتية.
Pichia stipitis نوع السلالة NRRL Y-7124 (CBS 5773)، والتي سميت مؤخرا Scheffersomyces stipitis، هو الأم البنتوز خميرة تخمر ما هو معروف جيدا للتخمر الزيلوز إلى إيثانول. 2،3 تطور سلالة NRRL Y-7124 تم متابعتها هنا لأنه قد تم توثيقه ل لديها القدرة العظمى من سلالات الخميرة الأم إلى تراكم الإيثانول القابل للاسترداد اقتصاديا يتجاوز 40 جم / لتر مع القليل ثانوية إكسيليتول. 4،5،6 وسائل الإعلام الأمثل، S. stipitis سلالة NRRL Y-7124 ينتج 70 غرام / لتر من الإيثانول في 40 ساعة (1.75 جم / لتر / ساعة) بعائد 0.41 ± 0.06 غ / ز في الثقافات كثافة عالية الخلية (الخلايا 6 جم / لتر). 7،8 المقاومة لمثبطات انزيم الإيثانول، فورفورال، وHMF كما تم الإبلاغ عنها، 9 و S. وقد صنفت stipitis بين الخمائر تخمر البنتوز أصلية الواعدة المتاحة لإنتج الإيثانول على نطاق تجارين من غنوسيللولوز وكان 10 هدفنا هو تطبيق تنوعا hydrolyzates lignocellulosic undetoxified والضغوط اختيار الإيثانول لإجبار تطور نحو مشتق أكثر قوة من سلالة NRRL Y-7124 مناسبة للتطبيقات الصناعية. ومن أهم الميزات المحسنة سعى كانت أسرع معدلات السكر امتصاص في hydrolyzates تركيزا، وانخفاض diauxy لاستخدام السكر مختلطة أكثر كفاءة، والتحمل أعلى من الإيثانول ومثبطات. تطبيق س. كان stipitis إلى hydrolyzates undetoxified محورا رئيسيا للبحث من أجل القضاء على واضاف نفقات التشغيل المرتبطة عمليات إزالة السموم هيدروليساتي، مثل overliming.
وقد طبقت اثنين hydrolyzates اعدة صناعيا لإجبار تطور: انزيم saccharified الألياف الأمونيا سابقة التجهيز التوسع حطب الذرة هيدروليساتي (AFEX CSH) وتمييع سابقة التجهيز حمض التبن هيدروليساتي الخمور (PSGHL) ويجري تطوير 11،12 AFEX تكنولوجيا المعالجة لتقليل إنتاج مثبطات انزيم، في حين تمثل المعالجة حمض المخففة التكنولوجيا الحالية بأقل تكلفة والأكثر شيوعا تمارس لفضح الكتلة الحيوية السليلوزية لتسكر الأنزيمية. PSGHL هو فصله من السليلوز المتبقية بعد المعالجة وغنية بشكل مميز في زيلوز من هيميسيلولوز تحلل، ونسبة قليلة من الجلوكوز. AFEX CSH والتراكيب PSGHL تختلف عن بعضها البعض في الجوانب الرئيسية التي تم استغلالها لإدارة عملية التطور. AFEX CSH هو أقل من ذلك في الألدهيدات الفوران ومثبطات حامض الخليك ولكن أعلى في الأحماض الأمينية ومصادر نيتروجين الأمونيا مقارنة مع PSGHL (الجدول 1). يقدم PSGHL تحديا إضافيا من الفركتوز يجري السكر السائد المتاحة. وهكذا PSGHL المناسب لإثراء خصيصا لتحسين استخدام الفركتوز في hydrolyzates، وضعف منع الاستخدام التجاري للالخميرة المتاحة. حتى بين الخمائر تخمر البنتوز الأم، والاعتماد على XYLO السكر الأمثلحد ذاتها لدعم نمو الخلايا وإصلاح يصبح أكثر صعوبة في hydrolyzates بسبب مجموعة متنوعة من الأسباب: نقص العناصر الغذائية، مثبطات مما تسبب في أضرار واسعة النطاق إلى الخلية السلامة الهيكلية، واضطراب التمثيل الغذائي بسبب الاختلالات الأكسدة 9 النيتروجين مكملات، خاصة في شكل الأحماض الأمينية، ويمكن أن تمثل تكلفة تشغيلية هامة للتخمير. وتمت دراسة تأثير مكملات النيتروجين على فحص العزلة والترتيب مع hydrolyzates التبن.
وقد أثرى تحسين الأفراد في السكان تتطور باستخدام الضغوط اختيار متعددة تعتمد على التنوع الجيني الطبيعي للس. السكان stipitis والطفرات المستحثة بواسطة التعرض لاثنين من hydrolyzates متنوعة، والإيثانول أو الأشعة فوق البنفسجية. طبقت ضغوط الانتقاء بالتوازي وفي سلسلة لاستكشاف التقدم تطور س. stipitis نحو المشتقات المطلوب قادرة على النمو والهياج بكفاءة في hydrolyzates(الشكل 1). وقد أنجزت زراعة المتكررة للسكان وظيفية في hydrolyzates تحديا متزايد في microplates توظيف سلسلة تخفيف إما 12٪ غلوكان CSH AFEX وإلا أعد PGSHL في 20٪ مواد صلبة التحميل. تطبيق نمو تحدى الإيثانول على زيلوز في الثقافة مستمرة مزيد من التحسين AFEX CSH تكيف السكان من خلال إثراء للالظواهر يدل أقل قابلية للإيثانول القمع من استخدام الفركتوز. وقد أظهرت هذه الميزة الأخيرة مؤخرا إشكالية لاستخدام البنتوز من سلالة NRRL Y-7124 بعد تخمير السكر. 8 التخصيب على PSGHL جرى استكشاف بجانب توسيع وظائف هيدروليساتي.
المشتقات المفترضة تحسين س stipitis NRRL Y-7124 تم عزل من كل مرحلة من مراحل عملية التطور باستخدام تخصيب المستهدفة تحت ظروف الإجهاد والطلاء تخفيف لاختيار المستعمرات من السكان الأكثر انتشارا. قريب أبعادواستخدمت مؤشرات الأداء (RPIs) لتصنيف سلالات على أساس الأداء العام، حيث تم تقييم السلوك الحركي على أنواع مختلفة هيدروليساتي والمكملات الغذائية المطبقة. على الرغم من النجاحات التي تحققت في إجراءات تكيف مختلفة لتحسين وظائف س. stipitis في hydrolyzates lignocellulosic وقد تم توثيق سابقا، والسلالات مما يدل على انتاج الايثانول اقتصادية على hydrolyzates undetoxified لم يتم ذكر سابقا. 13-17 عن طريق إجراءات تطور إلى أن تصور بمزيد من التفصيل هنا، Slininger وآخرون. 18 وضعت السلالات التي تحسن بشكل كبير خلال سلالة الأم NRRL Y-7124 وقادرون على انتاج> 40 جم / لتر من الإيثانول في AFEX CSH وانزيم هيدروليساتي التبن saccharified (SGH) تستكمل بشكل مناسب مع مصادر النيتروجين. هذه السلالات الجديدة ذات الفائدة في المستقبل إلى غنوسيللولوز النامية لصناعة الإيثانول وكأصحاب علم الجينوم إضافية لبناء دراساتعلى تلك السلالة التسلسل سابقا NRRL Y-11545. 19 دراسة الجينوم من أهم السلالات التي تنتج أثناء المراحل المختلفة لتطور diagramed في الشكل 1 أن إلقاء الضوء على التاريخ من التغيرات الجينية التي وقعت خلال تطوير تمهيدا لمزيد من البحوث تحسين السلالة.
Protocol
Representative Results
Discussion
Several steps were critical to the success of the evolution process. First, it is key to choose appropriate selection pressures to drive the population evolution toward the desired phenotypes that are needed for successful application. The following selective stresses were chosen for S. stipitis development and applied at appropriate times to guide enrichment for the desired phenotypes: increasing strengths of 12% glucan AFEX CSH (which forces growth and fermentation of diverse sugars in the presence of acetic a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
Riferimenti
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader’s Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
