Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Maximaliseren van het voordeel van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) voor onderzoek, ziektemodel, farmaceutische en klinische toepassingen vereist robuuste werkwijzen voor de grootschalige productie van functionele celtypes, waaronder hartspiercellen. Hier laten we zien dat de temporele manipulatie van WNT, TGF-β en SHH signaalwegen leidt tot zeer efficiënte cardiomyocyt differentiatie van eencellige door passage HPSC lijnen in zowel statische suspensie en geroerde suspensie bioreactorsystemen. Gebruikmakend van deze strategie heeft geleid tot ~ 100% kloppend bolletjes, consistent met> 80% troponine T-positieve cellen na 15 dagen van de cultuur, gevalideerd in meerdere HPSC lijnen. Wij rapporteren ook een variatie van dit protocol voor gebruik met cellijnen nog niet aangepast aan eencellige passage, waarvan het succes is geverifieerd in 42 HPSC lijnen. Hartspiercellen gegenereerd met behulp van deze protocollen uit te drukken lineage-specifieke markers en tonen verwacht electrophysiological functionaliteiten. Ons protocol biedt een eenvoudige, efficiënte en robuuste platform voor de grootschalige productie van humane hartspiercellen.
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), waaronder humane embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het vermogen van zelf-vernieuwing en het vermogen om te differentiëren in cellen van de drie embryonale kiemlagen 1,2. Vanwege deze kenmerken hPSCs een waardevolle en onbeperkte bron voor het genereren en schaalbare ziekte-relevante celtypen te modelleren menselijke ziekte 3-5, voor high-throughput screening van geneesmiddelen en toxiciteitstests 6,7 en potentieel voor klinische toepassingen 8 . Genereren van hartspiercellen uit hPSCs biedt de mogelijkheid om specifiek onderzoek naar de mechanismen van complexe menselijke hart- en vaatziekten en de mogelijke behandelingen eerder buiten het bestek van onze mogelijkheden vanwege het gebrek aan relevante diermodellen en / of de beschikbaarheid van primaire aangetaste weefsels.
Alle bovengenoemde toepassingen van hPSCs necessitate de productie van grote aantallen van hoogverrijkt en functionele hartspiercellen. Zo is de beschikbaarheid van een efficiënte, reproduceerbare en schaalbaar in vitro cardiale differentiatie protocol geschikt voor meerdere HPSC lijnen is van cruciaal belang. Conventionele cardiomyocyten differentiatie protocollen hebben verschillende strategieën toegepast, zoals embryoid lichaam formatie 9, co-kweektechnieken 10, inductie met cocktails van cytokinen 11 en eiwittransductiedomein methoden 12. Ondanks de vooruitgang in deze technieken, de meeste nog steeds last van slechte efficiency, vereisen dure groeifactoren, of aan te bieden beperkte universaliteit bij een poging om meerdere HPSC lijnen te gebruiken. Tot op heden zijn hieraan grenzen aan de productie van HPSC-afgeleide cardiomyocyten voor celtherapie studies in diermodellen en in de farmaceutische industrie voor geneesmiddelenonderzoek 13 ingesteld. Daarom is de ontwikkeling van robuuste en betaalbare technieken voor grote-schaal productie van functionele HPSC-afgeleide hartspiercellen in schaalbare kweeksystemen zou grotendeels hun commerciële en klinische toepassingen te vergemakkelijken.
In dit manuscript beschrijven we de ontwikkeling van een rendabele en geïntegreerde cardiale differentiatie systeem met hoge efficiëntie, reproduceerbaarheid en toepasbaarheid voor hESCs en hiPSCs gegenereerd uit een verscheidenheid aan bronnen en kweekwerkwijzen, zoals een werkwijze voor de grootschalige productie van zeer verrijkte populaties van HPSC-afgeleide cardiomyocyten onder toepassing van een bioreactor. Daarnaast hebben we dit protocol voor HPSC lijnen niet aangepast aan gratis en / of enkele celkweek voeder, zoals de nieuw opgerichte hiPSCs of grote cohorten van HPSC lijnen de analyse van de ziekte mechanisme relevant geoptimaliseerd.
Cardiomyocyten afgeleid van hPSCs is een zeer aantrekkelijke bron voor toepassing bij humane ziektemodel, drug screening / toxiciteitstests en, misschien in de toekomst regeneratieve therapieën. Een van de belangrijkste obstakels het gebruik van deze cellen is echter de mogelijkheid om voldoende hoogwaardig materiaal voor het daadwerkelijk gebruik. Met behulp van onze beschreven protocol, bieden wij een methode die deze beperking overwint.
Onlangs hebben synthetische kleine moleculen gerich…
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |