Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
Maksimere nytten av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) for forskning, sykdom modellering, farmasøytiske og kliniske applikasjoner krever robuste metoder for storskala produksjon av funksjonelle celletyper, inkludert cardiomyocytes. Her viser vi at den temporale manipulering av WNT, TGF-β, og SHH signalveier som fører til svært effektiv kardiomyocytt differensiering av enkelt-celle passert hPSC linjer i både statisk og suspensjonen omrørt suspensjon bioreaktorsystemer. Denne strategien resultert i ~ 100% slå kuler, konsekvent inneholder> 80% cardiac troponin T-positive celler etter 15 dager med kultur, validerte i flere hPSC linjer. Vi rapporterer også om en variant av denne protokollen for bruk med cellelinjer for øyeblikket ikke tilpasset encellet aging, suksessen som har blitt bekreftet i 42 hPSC linjer. Cardiomyocytes generert ved hjelp av disse protokollene uttrykke avstamning-spesifikke markører og viser forventet electrophysiological funksjonalitet. Vår protokoll presenterer en enkel, effektiv og robust plattform for storskala produksjon av menneskelige cardiomyocytes.
Introduction
Menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs), inkludert humane embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (hiPSCs), har evne til selvfornyelse og evnen til å differensiere i celler av de tre embryonale bakterie lag 1,2. På grunn av disse egenskaper, hPSCs tilveiebringe en verdifull og ubegrenset kilde for generering og skalerbar produksjon av sykdomsrelevant celletyper for å modellere human sykdom 3-5, for high-throughput screening medikament og toksisitetsanalyser 6,7 og potensielt for kliniske anvendelser 8 . Generering av kardiomyocytter fra hPSCs gir anledning til spesifikt å undersøke mekanismer for komplekse humane kardiovaskulære sykdommer og deres mulige behandlinger, som tidligere utenfor omfanget av de muligheter på grunn av mangel på relevante dyremodeller og / eller tilgjengeligheten av berørte primære vev.
Alle de ovennevnte anvendelser av hPSCs necessitate produksjon av massive antall høyanriket og funksjonelle cardiomyocytes. Dermed en effektiv, reproduserbar og skalerbar in vitro hjertestans differensiering protokoll egnet for flere hPSC linjer er tilgjengeligheten av avgjørende. Konvensjonelle kardiomyocytt differensiering protokoller har ansatt ulike strategier som embryoid kroppen formasjon 9, co-kultur teknikker 10, induksjon med cocktails av cytokiner 11 og protein overføringsmetoder 12. Til tross for fremskritt i disse teknikkene, de fleste fortsatt lider av dårlig effektivitet, krever dyre vekstfaktorer, eller tilby begrenset universalitet når du forsøker å bruke flere hPSC linjer. Hittil har disse utfordringene setter grenser for produksjon av hPSC-avledet cardiomyocytes for celleterapi studier i dyremodeller, samt i den farmasøytiske industrien for legemiddelforskning 13. Derfor er utviklingen av robuste og rimelige teknikker for stor-skala produksjon av funksjonelle hPSC-avledet cardiomyocytes i skalerbare kultur-systemer vil i stor grad legge til rette for sine kommersielle og kliniske applikasjoner.
I dette manuskriptet, rapporterer vi å utvikle en kostnadseffektiv og integrert kardial differensiering system med høy effektivitet, reproduserbarhet og anvendbarhet til hESCs og hiPSCs generert fra en rekke kilder og kulturmetoder, herunder en fremgangsmåte for storskala produksjon av høyt anrikede populasjoner av hPSC-avledet cardiomyocytes med en bioreaktor. I tillegg har vi optimalisert denne protokollen for hPSC linjer ikke er tilpasset mater fri og / eller enkeltcellekultur, for eksempel nyetablerte hiPSCs eller store årskull av hPSC linjer som er relevante for analyse av sykdom mekanisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kardiomyocytter avledet fra hPSCs er en svært attraktiv kilde for anvendelse i human sykdom modellering, legemiddelscreening / toksisitetstesting og, kanskje i fremtiden, regenererende behandling. En av de største hindringer for å bruke disse cellene er imidlertid evnen til å gi tilstrekkelig høy kvalitet materiale for deres effektive bruk. Ved hjelp av vår beskrevet protokollen, tilbyr vi en metode som overvinner denne begrensningen.
Nylig har syntetiske små molekyler rettet mot spes…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
