Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54280
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

Corneale epitheliale cellen (LME) continu afgestoten in traanfilm, terwijl ze tegelijkertijd vervangen door cellen van de limbus en corneale epitheliale basale lagen. 1 verschillende extrinsieke stressoren kunnen de apoptose en afschilfering van CECs induceren. 2 De heat shock eiwitten (HSP) zijn sterk geconserveerd en kunnen worden onderverdeeld in twee families op basis van molecuulgrootte. 3 de grootste HSP-familie omvat HSP90, HSP70 en HSP60 en de kleine familie omvat HSP27. 4 de fosforylatie van HSP27 speelt een belangrijke rol in celoverleving spelen en is vereist voor celmigratie vanwege de rol van dit eiwit in actine remodellering. 5-7 Daarom hebben we geprobeerd om de mogelijke rol van HSP27 fosforylatie in CEC migratie en apoptose getest in een in vitro model van epitheliale wondgenezing.

RNA-interferentie (RNAi) met behulp van kleine of korte interfererende RNA (siRNA) heeft generated belangstelling voor zowel fundamenteel als toegepast biologie, omdat het mogelijk maakt de expressie van elk gen van belang worden overreden. 8 Hierin gebruikten we HSP27-specifiek siRNA om de bijdrage van HSP27 CEC wondgenezing en apoptose beoordelen. Traditionele werkwijzen voor RNAi gen knock-in cellen gebruiken synthetische RNA duplexen, waaronder twee niet-gemodificeerd 21-meer oligonucleotiden die kunnen worden samengesteld om siRNA's te maken. De RNAi siRNA dat we in deze studie is een eenvoudige en efficiënte methode om cellen te transfecteren, en dit reagens werkt met verschillende geïmmortaliseerde cellijnen. In deze studie tonen we de voor deze analyse methoden, met inbegrip van een scratch-geïnduceerde directionele wond assay, western blotting, siRNA transfectie assay, immunofluorescentietest, en flowcytometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Line

  1. Cultuur 10 6-telomerase geïmmortaliseerde humane corneale epitheelcellen (HCECs) in een 6-puts plaat (dichtheid: 1039,9 cellen / mm 2) in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer via luchtwegepitheel groeimedium (BEGM) tot bereiken ze 95% samenvloeiing.

2. Western Blot Analyse Na het aanmaken van Epitheliale Scratch Wonden

  1. Streak een steriele 200 ul pipetpunt over het oppervlak van een putje van confluente cultuur HCECs viermaal per schaaltje in een biologische veiligheidskast (klasse II, Type A2) en incubeer HCECs afzonderlijk in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer gedurende 1, 5, 10, 30, 60 en 120 min.
  2. Gebruik een 6-wells plaat zes verschillende monsters volgens de incubatietijd na corneale epitheel verwonding.
  3. Wassen gewonden HCEC monolagen driemaal met 1x PBS en voeg 2,0 ml BEGM aan elk putje.
  4. Maak HCECs gebruik van 2ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) per putje gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 900 g gedurende 5 min in een 15 ml buis en zuig trypsine-EDTA met een 1 ml pipet.
  5. Schorsen HCECs met 1 ml 1x PBS en overbrengen naar een 1,5 ml buis.
  6. Centrifugeer HCECs bij 10.000 xg gedurende 15 sec en zuig 1x PBS onder toepassing van een 1 ml pipet.
  7. Resuspendeer HCECs in 100 ul ijskoude lysisbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride [PMSF], proteaseremmers [1 pM pepstatine A, 1 uM leupeptine en 0,1 uM aprotinine] en 0,5% Triton X-100 [pH 7]) en goed mengen.
  8. Incubeer cellen gedurende 30 minuten op ijs om cellysis te induceren.
  9. Centrifugeer lysaten bij 4 ° C bij 10.000 xg gedurende 15 min, en vervolgens over supernatanten vers 1,5 ml buisjes (90 gl aliquots) en bewaar ze bij -80 ° C.
  10. Bepaal totale eiwitconcentraties van cellysaten met behulp van de Bradford protein assay. 9
  11. Load 30 ug totaal cel eiwitten in een 10% of 12% acrylamide gel voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en daarna elektroforetisch overdracht gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose filters met een 200 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C te gebruiken in western blot assays.
  12. Blok nitrocellulose filtermembranen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur, voeg primaire konijnen polyklonale antilichamen tegen niet-gefosforyleerd HSP27 (1: 1000 verdunning) of primaire konijnen polyklonaal antilichaam tegen gefosforyleerd HSP27 (1 : 1000 verdunning) in 5% runderserumalbumine (BSA), en incubeer de membranen overnacht bij 4 ° C op een schudder.
  13. Detecteren immuunreactieve banden middels mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn antilichamen (1: 10.000 verdunning) in 5% BSA na het wassen gedurende 10 minuten 3 keer met TBST.
  14. Incubeer het membraan in de western blotting luminol reagentia (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membraan) gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
  15. Verwijder het membraan uit reagens oplossing verwijdert overtollige vloeistof met een absorberende handdoek, en plaats in een plastic zeil protector.
  16. Werken in een donkere kamer met een kluis licht, plaatsen bedekt membraan in een film cassette met eiwit zijde naar boven.
  17. Plaats röntgenfilm bovenop membraan en blootgesteld gedurende 1 minuut.

3. siRNA Transfectie Assay 10

  1. Cultuur HCECs bij 5 x 10 5 cellen / putje in een 6-wells plaat in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer via BEGM totdat ze 95% confluentie bereiken.
  2. Verdun de transfectiereagens (2,5 of 7,5 pl) met 100 ul verminderde serum medium voor transfectie (de verdunningsfactor was 41 of 14,3) en los de HSP27-specifieke en scrambled controle siRNA in 100 pl gereduceerd serum medium te creëren 10 of 50 nM HSP27-specifieke en scrambled siRNA controle.
  3. Meng 100 μ; L siRNA oplossing met 100 gl verdunde transfectiereagens (1: 1 verhouding) en incuberen van het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Voeg de siRNA-lipidecomplexen aan cellen. Dan na 4 uur veranderingsmedia voltooid BEGM en incubeer de cellen gedurende 2 dagen bij 37 ° C.
  5. Analyseer getransfecteerde cellen door western blotting, zoals beschreven in de secties 4,1-4,7.

4. Western Blot Assay voor siRNA getransfecteerde cellen 11

  1. Extract HSP27-specifieke en scrambled controle-siRNA getransfecteerde HCECs in een biologische veiligheidskast met 100 ul ijskoude lysisbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), proteaseremmers en 0,5% Triton X-100, pH 7).
  2. Incubeer cellen gedurende 30 minuten op ijs om cellysis te induceren.
  3. Pellet lysaten bij 10.000 g gedurende 15 min en vervolgens over te dragen supernatanten frisse 1,5 ml tubes (90 gl aliquots) en bewaar ze bij -80 ° C.
  4. Bepaal proteïneconcentraties van de cellysaten met behulp van de Bradford eiwit assay. 9
  5. Laad monsters met gelijke hoeveelheden van de totale celeiwitten op een 10% of 12% acrylamidegel, onderwerpen de gel aan SDS-PAGE en elektroforetisch overdracht van de gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose filters met een 200 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C gebruikt in western blot assays.
  6. Blok nitrocellulose filtermembranen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur, voeg primaire antilichamen tegen gefosforyleerd en niet-gefosforyleerd HSP27 (1: 1000 verdunning), gefosforyleerde Akt (1: 1000 verdunning), niet-gefosforyleerde Akt (1: 1000 verdunning gebruikt als celoverleving marker), Bcl-2-geassocieerde X eiwit (1: 1000 verdunning gebruikt als een pro-apoptotisch eiwit) en glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200 verdunning gebruikt als beladingscontrole) in 5% runderserumalbumine (BSA), enIncubeer de membranen overnacht bij 4 ° C op een schudder.
  7. Detecteren immuunreactieve banden middels mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn antilichamen (1: 10.000 verdunning) in 5% BSA na 3 keer wassen met TBST, 10 min per wasbeurt.
  8. Incubeer het membraan in de western blotting luminol reagentia (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membraan) gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
  9. Verwijder het membraan uit reagens oplossing verwijdert overtollige vloeistof met een absorberende handdoek, en plaats in een plastic zeil protector.
  10. Werken in een donkere kamer met een kluis licht, plaatst het overdekte membraan in een film cassette met het eiwit zijde naar boven.
  11. Plaats röntgenfilm bovenop het membraan en blootgesteld gedurende 1 minuut.

5. Scratch-geïnduceerde Directional verwonden Assay Evaluatie van de Cel Migratie 12

  1. In een biologisch veiligheidskabinet, maak een wond door over het oppervlak te slepen een steriele pipet tip van een goed die confluente culturen vanHSP27-specifieke siRNA getransfecteerde of roerei controle-siRNA getransfecteerde HCECs.
  2. Onmiddellijk na verwonding, was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en te onderhouden in BEGM culturen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer gedurende 24 uur na verwonding.
  3. Fotograferen HCEC beelden met behulp van een rechtopstaande microscoop bij 100X vergroting 24 uur na verwonding en uit te voeren achtergrond afvlakking met behulp van de Filter commando in beeldanalyse software.
  4. Met behulp van de opdracht Select Metingen, bepalen de Area of ​​Interest (AOI) met dezelfde grootte veelhoekige vorm die loodrecht kan dekken van begin tot eind van de oorspronkelijke wond, en het bepalen van drie verschillende AOI in het gewonde gebied van elk monster.
  5. Automatisch tellen het aantal cellen in elk veld met behulp van de graaf / Size Maatregel menu-opties.

6. Flowcytometrieanalyse van apoptose

  1. Cultuur HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde en controleiRNA getransfecteerde HCECs bevattende 10 nM siRNA elk bij een concentratie van 5 x 10 5 cellen / putje in 6-putjesplaten tot de cellen bereikt 95% confluentie in een 37 ° C incubator met 5% CO2 atmosfeer in BEGM.
  2. Los HCECs gebruik 2 ml 0,25% trypsine-EDTA per putje gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 900 g gedurende 5 min in een 15 ml buis en zuig trypsine-EDTA met een 1 ml pipet.
  3. Was de cellen tweemaal met koud PBS en resuspendeer de cellen in 1x bindingsbuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl en 25 mM CaCl2) bij een concentratie van 10 6 cellen / ml.
  4. Transfer 100 ul celsuspensie (1 x 10 5 cellen) in een 5 ml cultuur buis.
  5. Voeg 5 ul fluorescéine isothiocyanaat-geconjugeerd annexine V en 5 ui propidium iodide.
  6. Voorzichtig vortex de cellen en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  7. Voeg 200 ul van 1 x bindingsbuffer aan elke buis en analyseren van de cellen door een stroom cytometer binnen 1 uur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De expressie van HSP27 gefosforyleerde significant verhoogd 5, 10 en 30 minuten na kras verwonding vergeleken met verwonde HCECs 13. Western blot analyse toonde dat de expressie van HSP27 en gefosforyleerde Akt gefosforyleerd waren beide aanzienlijk verminderd, terwijl de expressie van Bax aanzienlijk HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde HCECs (Figuur 1A-E) verhoogd. De gefosforyleerd HSP27 expressie werd verminderd met 30% en 40% in 10 nm en 50 nm van HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde cellen, respectievelijk, in vergelijking met de controle-siRNA getransfecteerde cellen, maar de gefosforyleerd HSP27 expressie werd niet verminderd (afbeelding 1A-B ). Bovendien werd de niet-gefosforyleerde HSP27 expressie verminderd met 20% en 30% bij 10 nM en 50 nM van HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde cellen, respectievelijk, maar de niet-gefosforyleerde HSP27 expressie werd niet verminderd (figuur 1A en C </ Strong>).

De scratch-geïnduceerde verwonding directionele test geven aan dat 24 uur na verwonding, HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde cellen bij 10 en 50 nM vertoonden verminderde migratie (figuur 2). Bovendien HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde HCECs ondergingen meer apoptotische en necrotische celdood in vergelijking met scrambled controle-siRNA getransfecteerde cellen door flowcytometrie (Figuur 3).

Figuur 1
Figuur 1. Western blot-analyse met antilichamen tegen gefosforyleerd HSP27 (p-HSP27), niet-gefosforyleerd HSP27 (niet-p-HSP27), gefosforyleerde Akt (Akt-p) als een cel-overleving marker, niet-gefosforyleerd Akt (non- p-Akt), Bcl-X 2eassociated eiwit (Bax) als een pro-apoptotisch eiwit, en GAPDH (a). De expressie van gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde en HSP27 gefosforyleerde Akt significant verlaagd (B - D), maar de expressie van Bax aanzienlijk toegenomen in de HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde HCECs (E), vergeleken met dat waargenomen in de controle-siRNA getransfecteerde cellen (alle p <0,05). De gefosforyleerde HSP27 expressie werd verminderd met 30% en 40% bij 10 nM en 50 nM van HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde cellen vergeleken met mock controle, respectievelijk, maar de gefosforyleerde HSP27 expressie werd niet verminderd 10 nM en 50 nM controle siRNA getransfecteerde cellen (B). **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §, §§: een statistisch significant verschil tussen de groepen (p <0,05). De fout balken geven de standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

"> Figuur 2
Figuur 2. Scratch-geïnduceerde directionele verwonding test om celmigratie te evalueren na verwonding in-siRNA getransfecteerde HCECs. Een kras wond werd in controle en HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde cellen (A). Cellen werden verwijderd uit de "gesleept" gebieden. Op 24 uur na verwonding, 10 en 50 nM van HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde cellen vertoonden een lager aantal migrerende cellen in vergelijking met 10 en 50 nM controle-siRNA getransfecteerde cellen (B). ** En * duidt op een statistisch significant verschil tussen de groepen (p <0,05). De gegevens worden getoond als gemiddelden ± standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3 <br /> Figuur 3. Flowcytometrie van 50 nM scrambled controle siRNA en HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde menselijke corneale epitheelcellen (HCECs) gemerkt met annexine V en PI (A en B). Het percentage van de totale cellen in kwadranten overeen met vroege apoptotische cellen (annexine V-positieve en PI-negatieve cellen, Q4, rechtsonder), late apoptotische cellen (annexine V-positieve en PI-positieve cellen, Q2, rechtsboven), en necrotische cellen (annexine V-negatief en PI-positieve cellen, Q1, linksboven). HSP27-specifieke siRNA-transfecteren HCECs had meer apoptotische en necrotische celdood dan controle-siRNA getransfecteerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen financiële of geheime belangen in materialen of methoden in deze studie genoemd.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de Student Research Grant (13-14) van de Universiteit van Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea en een subsidie ​​(2014-464) van de Asan Institute for Life Sciences, Seoul, Korea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea  CHC-777A2-06 Class II, Type A2 
Stealth RNAi™ siRNA Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM Lonza, Inc., Walkersville, MD CC-3171, CC4175 Bronchial epithelium growth medium 
Protease inhibitor  Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO P8340 ,P7626 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay  Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA #500-0001 Bradford protein assay 
Nitrocellulose filters  Amersham, Little Chalfont, UK RPN3032D Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27  Abcam Inc., Cambridge, MA ab12351 1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85) Abcam Inc., Cambridge, MA ab5594 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent  Invitrogen, Carlsbad, CA 13-778-075 Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473) Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4060 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4061 1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4062 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA No. 4063 1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA NCI1460KR 1:10,000 dilution
OPTI-MEM Invitrogen, Carlsbad, CA 31985 reduced serum medium for transfection
Image analysis software Olympus, Inc., Tokyo, Japan Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder  Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany T145.2
Tris  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0497
Sodium Chloride  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0241
Six well culture plate Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 140675 35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 142475
Orbital shaker N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea NB1015
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2323 
BDFACSCantoTM II BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ Flow cytometry
X-Ray Film Kodak, Rochester, NY Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen 
western blotting luminol reagent Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 556547

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).
  4. Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
  5. Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
  6. Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
  7. Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
  8. Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).
  9. Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
  10. Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
  11. Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
  12. Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
  13. Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).

Tags

Genetics heat shock eiwit 27 corneale epitheel corneale epitheliale wondgenezing epitheelcel apoptose epithele migratie RNA interferentie siRNA moleculaire biologie
RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S.,… More

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S., Kim, E. S., Tchah, H., Kim, J. Y. RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54280, doi:10.3791/54280 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter