Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов
Summary
Этот протокол описывает скальпель погрузо-флуоресцентный краситель метод передачи, который измеряет межклеточной коммуникации через щелевых контактов каналов. Gap узловой межклеточной связи является одним из основных клеточный процесс, с помощью которого гомеостаз ткани сохраняется и нарушение этой клеточной сигнализации имеет неблагоприятные последствия для здоровья.
Abstract
Этот протокол описывает погрузо-флуоресцентный перенос красителя скальпель техника (SL-DT), который измеряет межклеточной коммуникации через щелевых каналов, который является одним из основных межклеточное процесс, с помощью которого поддерживается гомеостаз ткани. Прерывание разрыва соединительного межклеточной коммуникации (GJIC) путем токсикантов, токсинов, лекарств и т.д. было связано с многочисленными неблагоприятными последствиями для здоровья. Многие генетические основе заболеваний человека были связаны с мутациями в генах щелевых контактов. Техника SL-DT представляет собой простой функциональный тест для одновременной оценки GJIC в большой популяции клеток. Анализ включает в себя предварительное нагружение клеток с флуоресцентным красителем, кратко возмущающее клеточную мембрану с скальпелем через популяцию клеток. Флуоресцентный краситель затем дают возможность пройти через щелевых каналов в соседних сотах в течение указанного времени. Анализ затем останавливали добавлением формалина к клеткам. Распространение флуофлуоресцентным красителем через популяцию клеток оценивают с помощью микроскопа эпифлуоресцентной и изображения анализируются с любым количеством морфометрических программных пакетов, которые доступны, в том числе свободных программных пакетов, найденных на свободном доступе. Этот анализ был также адаптирован для исследований в естественных условиях с использованием срезов тканей из различных органов у обработанных животных. В целом, анализ SL-DT может служить широкий спектр экстракорпорального фармакологических и токсикологических потребностей, а также потенциально могут быть адаптированы для высокой пропускной способности, установленных планом систем с автоматизированной флуоресцентной микроскопии визуализации и анализа для выяснения больше образцов в более короткие сроки.
Introduction
Общая цель этого метода является обеспечение простой, всеобъемлющий и относительно недорогой метод для оценки потенциальной токсичности соединений. Это подход , в пробирке , который может быть использован в нескольких клеточных линиях. Стандартная клеточная биология лаборатории, оснащенные эпифлуоресцентной микроскопов можно проводить исследования с помощью этого теста.
Наши базовые знания клеточных функций была сильно зависит от биопроб в пробирке, и стал одним из важнейших компонентов в токсикологических оценках лекарственных средств , загрязняющих окружающую среду, а также пищевых продуктов родился загрязняющих веществ. К сожалению, нет ни одного в пробирке системы биоанализа , которые могут комплексно удовлетворить требованиям всех токсикологических оценок. Многие в анализах пробирке разработаны и оптимизированы для оценки, а также оценки конкретного биохимического или молекулярной конечной точки. Они довольно часто в сочетании с высокой пропускной способностью, созданной для отражения возмущенияопределенный пути передачи сигнала, такие как эстроген-рецептор сигнализации 1. Эта стратегия была довольно успешной, но обширное количество путей передачи сигнала, участвующих в экспрессии генов делает задачу выбора конкретного сигнального пути для оценки достаточно сложной. Высокие сквозные протоколы, поставленные в настоящее время разрабатываются и используются для одновременного измерения многочисленных сигнальных путей, который был один из подходов к преодолению некоторых ограничений единичных анализов. Тем не менее, не все сигнальные пути были успешно включены в более всеобъемлющие подходы, а также новые сигнальные пути постоянно обнаружили, что еще больше усложняет этот процесс оценки. Используя обширные количества подходов в пробирке, в частности , высокой пропускной поставленных систем, для комплексных токсикологические оценки также являются очень дорогими и не способствуют большей одного исследователя под руководством научно – исследовательских проектов.
GJIC представляет собой процесс ВИГhtly контролируется изменением напряжения, концентрации кальция, рН, окислительно – восстановительного баланса, регулируемые основными трансдукции внутриклеточного сигнала путей и взаимодействия с мембраной и цитоскелета белков 2,3. Таким образом, ингибирование GJIC могут отражать различные типы клеточного стресса, нарушение функций различных клеточных функций, или возмущения различных путей передачи сигналов. Другой подход к преодолению использования ограниченных биопробы трансдукции сигнала , чтобы воспользоваться биологическими явлениями , что многие, если не большинство, пути передачи сигналов дополнительно модулируется кооперативных межклеточных сигнальных систем через щелевых контактов каналов 4-8. Несмотря на то, межклеточные системы сигнализации также многочисленные и при многократном управления токопровода, межклеточное передача сигналов через щелевых каналов в конечном счете, зависит от каналов открываются, частично закрытое или полностью закрыта. Это обеспечивает конечную точку, которая может быть легко измерить с помощью различногов пробирке биопроб систем 7. Учитывая , что гомеостатическое набор точка ткани требует открытых каналов, определения влияния соединений на разрыв соединительного межклеточной коммуникации (GJIC) представляет собой более комплексный подход при определении потенциальных токсических эффектов соединений 4,8. По сути, это критическое биологическое явление, которое играет центральную роль в координации нескольких событий передачи сигналов, контролирующих экспрессию генов обеспечивает широкую оценку токсических эффектов. Таким образом, биопробы, которые оценивают GJIC являются отличной отправной точкой для оценки токсичностью соединений.
Наиболее обширные методы, используемые для оценки GJIC основаны на предварительной загрузки клеток с флуоресцентным зондом, а затем мониторинга миграции красителя из загруженной клетки или клеток на соседние ячейки. Методы для предварительной загрузки красителя вовлекли микроинъекции 9, царапать загрузки 10, и метиловых эфиров зондов 11 </suр>. Перенос красителя , погрузо-флуоресцентный метод скальпель (SL-ДТ) является модификацией нагрузки скребкового – краситель анализа переноса , разработанный Эль Fouly 10. Вместо того , чтобы более инвазивной передряги, метод скальпель загрузки этого отчета включает в себя нежный рулон скальпелем с круглым лезвием через монослой клеток , которые сводят к минимуму повреждения инвазивный (рисунок 1). Преимущества этого метода являются токсикологическая оценка популяции клеток, а не отдельных клеток анализа микроинъекции. Кроме того, простота данного метода позволяет быстро выявить нескольких пластин в течение короткого времени, тогда как методы, использующие методы микроинъекции и методы, которые используют метиловые эфиры флуоресцентных зондов потребляют значительно больше времени и требует значительно более высокий уровень квалификации.
Хотя не существует ни одного метода, чтобы удовлетворить все потребности изучения GJIC; анализ SL-DT представляет собой простой, достаточно недорогой и универсальный тест, который можетудовлетворения многих потребностей для первоначальных оценок токсичности различных соединений. Основные преимущества включают в себя: простота, отсутствие особой необходимости в оборудовании или навыков, которые необходимы для других методов, таких как микроинъекции, флуоресцентного восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) анализа и локальной активации молекулярных флуоресцентных анализов зондов, быстрой и одновременной оценки GJIC в большой количество клеток, способствует высокой пропускной способности установки с автоматизированной флуоресцентной микроскопии визуализации и анализа, а также возможности его адаптации для исследований в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ SL-DT представляет собой простой и универсальный метод измерения GJIC, но есть несколько важных проблем, которые должны быть учтены при разработке соответствующих экспериментальных протоколов. Для получения надежных измерений GJIC с помощью анализа SL-DT должно быть хорошее распростр…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C., Travis, C. C. . Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. , 165-179 (1989).
- Trosko, J. E., Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. . Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. , 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H., Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. , 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. r. o. s. k. o., Dittmar, T., Zaenkar, K. . Stem Cells and Cancer. , 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
