Bloccare Registrazioni patch intatta dei gangli dorsali da ratti adulti
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
studi patch clamp da gangli spinali (DRG) neuroni hanno aumentato la nostra comprensione del sistema nervoso periferico. Attualmente, la maggior parte delle registrazioni sono condotti sui neuroni DRG dissociate, che è una preparazione standard per la maggior parte dei laboratori. le proprietà neuronali, tuttavia, possono essere alterati da danno assonale derivante dalla digestione enzima utilizzato per l'acquisizione neuroni dissociati. Inoltre, i preparativi dei neuroni dissociate non può rappresentare pienamente il microambiente delle DRG da perdita di contatto con le cellule gliali satellite che circondano i neuroni sensoriali primarie è una conseguenza inevitabile di questo metodo. Per superare le limitazioni nell'uso convenzionali neuroni DRG dissociati per le registrazioni di patch clamp, in questo rapporto si descrive un metodo per preparare DRG intatte e condurre le registrazioni di patch clamp su singoli neuroni primari sensoriali ex vivo. Questo approccio permette la preparazione rapida e semplice DRG intatti, imitando diVivo condizioni mantenendo neuroni DRG associati ai loro cellule circostanti gliali satellitare e membrana basale. Inoltre, il metodo evita danno assonale dalla manipolazione e digestione enzimatica come quando dissociare DRG. Questa preparazione ex vivo può inoltre essere usato per studiare l'interazione tra i neuroni sensoriali primarie e cellule gliali satellitare.
Introduction
La sensazione è essenziale per la sopravvivenza e il benessere di un organismo. La trasmissione di stimoli dipende dalle vie sensoriali da terminazioni periferiche di assoni da neuroni sensoriali primarie. neuroni sensoriali primari, ad eccezione del nucleo mesencefalico del nervo trigemino, si trovano nella trigemino gangli e dei gangli spinali (DRG). Essi servono come custodi delle informazioni sensoriali 1. A livello della membrana perikarial, proprio come ai terminali centrali e periferici, neuroni DRG esprimono recettori e canali ionici, come i recettori del glutammato, recettori TNF alfa, Canale Trp cazione membro sottofamiglia V 1 (TRPV1), i canali del sodio, ecc 2 -7. registrazioni di patch clamp della membrana perikarial consentono comprensione cambiamenti funzionali di molti di questi recettori e canali in tutto il neurone.
La tecnica di registrazione patch clamp è un potente strumento per la stumorire le attività dei canali o recettori e un gran numero di studi sono stati condotti mediante l'applicazione di questa tecnica sui neuroni DRG 8-10. Nella maggior parte degli studi DRG viene rimosso tagliando le radichette dorsali e spinali del nervo vicino al ganglio. Dopo macinazione, il ganglio viene poi posto in enzimi digestivi che provocano dissociazione dei neuroni DRG, che possono poi essere registrate immediatamente o in coltura per diversi giorni prima della registrazione. Purtroppo, la dissociazione dei neuroni DRG comporta un assotomia necessario vicino al perikarya. Una volta dissociato e axotomized, neuroni DRG subiscono cambiamenti fenotipici così come i cambiamenti nella eccitabilità della membrana 11,12. La perdita di contatto tra la perikarya dei singoli neuroni e le cellule gliali satellite che normalmente li circonda può contribuire a questi cambiamenti 13. Il crosstalk tra i neuroni e cellule gliali satellitare è sia essenziale in condizioni fisiologiche e nell'adattamento di pathologcondizioni iCal come quelli che porta al dolore intrattabile 14,15. Sarebbe difficile per studiare l'interazione tra neuroni e cellule gliali satelliti usando una preparazione DRG dissociato.
DRG intatte, invece, forniscono avvicinarle alle condizioni in vivo. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio, così come alcuni altri gruppi, ha utilizzato DRG intatte da ratti adulti di indagare i cambiamenti dei neuroni sensoriali primari in diverse condizioni associate a dolore cronico 3-5,11,15-17. Sebbene le tecniche utilizzate in questi studi sono alquanto stabiliti, una descrizione passo-passo non è ancora stata pubblicata. Nel presente manoscritto, si descrive un modo comodo e veloce da preparare DRG intatte e il loro utilizzo per le registrazioni di patch clamp.
Protocol
Representative Results
Discussion
We report a method to prepare whole DRGs for patch clamp studies. There are several key elements for preparing an ideal specimen. Firstly, it is important to dissect the DRGs with dorsal roots attached. After that, the epineurium need to be carefully removed while avoiding damage to the neurons. Finally, to expose the neurons and their surrounding satellite glial cells, it is necessary to digest the remaining connective tissue. Intact DRGs from adult rats prepared with the method described here will maintain good viabili…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
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