Este protocolo de extracção modificado melhora RNA e DNA rendimentos provenientes de regiões mais precisamente alvo de interesse nos blocos de tecido histopatológicos.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
Pesquisa com biomarcadores Genomic procura identificar correlatos moleculares que precisa e confiável reflectem o estado da doença, e fazê-lo de uma forma clinicamente útil. 1 Desenvolvimento de biomarcador é dependente de análise retrospectiva de amostras de tecido bem anotados. amostras de tecidos doentes e normais são armazenadas tecido como fresco congelado em biobancos especializadas ou como tecido embebido em parafina (FFPET) bloqueia formalina-fixo em arquivos clínicos. O tecido fresco congelado permite a extracção de ácidos nucleicos de elevada qualidade e tem sido amplamente utilizado em estudos genómicos descoberta de biomarcadores 2,3. No entanto, menos amostras de tecido estão disponíveis em bancos biológicos e estudando tais tecido apresenta uma tendência para as amostras maiores, categorias incomuns da doença, e pacientes atendidos em centros especializados com maiores capacidades para o tecido banco. 4 FFPET, em contraste, é o método de armazenamento padrão para tecidos humanos e animais doentes. Enquanto blocos FFPET m manter celularorphology, o processo de fixação ligações cruzadas outros constituintes celulares para os ácidos nucleicos. ARN e ADN com ligações cruzadas são recuperáveis, mas apenas em formas degradadas, altamente fragmentados 5,6. No entanto, estes fragmentos de ADN e ARN são acessíveis à análise por uma variedade crescente de ensaios, incluindo a expressão de mRNA, a hipermetilação do ADN, e a sequência alvo. 7,8 para explorar esta possibilidade na grande quantidade e variedade de FFPET disponível para investigação, existe uma necessidade de um protocolo de extracção eficiente e fiável.
Uma grande proporção de pesquisa com biomarcadores em tecidos concentra-se em câncer. Como outros tipos de tecido doente, tecido de câncer muitas vezes mostra heterogeneidade regional significativa na preservação celular e tipo de célula. Uma vez que a investigação biomarcador baseia-se na capacidade de correlacionar componentes do tecido doente com características moleculares, um passo fundamental deste processo é o de colheita precisa do tecido que é bem conservada e enriquecido para o disease em estudo. Em FFPET, duas técnicas de enriquecimento são frequentemente utilizados: captura a laser microdissecção (LCM), e secção micrótomo. LCM permite altamente focalizado de colheita de tecido e pode ser utilizado para isolar os tipos de células específicas, bem preservadas em tecidos heterogéneos. 9,10 No entanto, LCM requer equipamento caro e é proibitivamente tempo para consumir um grande número de amostras. Micrótomo de corte é um processo mais amplamente utilizado em secções finas foram cortadas de blocos FFPET. 11,12 secções micrótomo de corte muitas vezes incluem tecido que é heterogénea na preservação de células (por exemplo, vs necrótica bem preservada) e a composição (por exemplo, cancro vs parênquima benigna), e, portanto, pode levar à homogeneização de características moleculares melhores investigados separadamente. Assim, existe uma necessidade para um método de alto rendimento que enriquece para células de interesse. Um terceiro método, o isolamento de ácidos nucleicos a partir de núcleos de FFPET, fornece este enriquecimento, é adequado para alta atravhput protocolos, e tem sido utilizado por outros para isolar o ARN ou ADN a partir de núcleos de tecido separadas. 7,13,14
Um certo número de protocolos publicados especificar métodos de extracção de ácidos nucleicos a partir de FFPET (Tabela 1). No entanto, os protocolos onde RNA e DNA são extraídos do mesmo tecido foram otimizados para secções de tecido do micrótomo, mas não para núcleos de tecido. 15,16 protocolos Da mesma forma, publicados que oferecem uma maior especificidade de tecido, seja através de núcleos de tecidos ou microdissecações de slides, especifique procedimentos para a extracção do ADN, mas não ARN. 7,17 Aqui, um protocolo optimizado para extracção dupla de ambos o ADN e ARN a partir do mesmo núcleo tecido é demonstrada. núcleos de tecido são colhidas através da inserção de tissue microarray (TMA) socos em regiões de interesse mapeadas em blocos FFPET. O mapeamento é realizado por anotar uma lâmina de microscópio com uma caneta de marcador e transferir a anotação para a superfície correspondente da FFPEBloco t (Figura 1).
Antes do trabalho que conduziu ao desenvolvimento da presente protocolo incluiu uma comparação dos vários sistemas de extracção de ácido nucleico disponíveis no comércio. Nesta comparação, as alterações aos protocolos comerciais, como descrito abaixo, desde os mais altos rendimentos de ADN e ARN e de qualidade (Selvarajah et ai., Na Prep). Núcleos de tecido são mais espessas do que as secções 5-10 micron uM tipicamente utilizados em protocolos de extracção FFPET 11,12,14,18 – 20, e pode conter quantidades mais variáveis de parafina. Para compensar esta situação, desparafinização foi melhorada por repetição de xileno e etanol tratamentos e através da introdução de um passo de homogeneização motorizado (Figura 1). Além disso, os tempos de digestão com proteinase K foram alongada para aumentar o rendimento de ADN. No geral, este protocolo é rentável e possibilita o estabelecimento de ligações entre as características moleculares e histopatológicos da doença em large, populações bem caracterizadas. O protocolo em sua totalidade pode ser realizada de forma confiável dentro de 2 dias, incluindo 3 horas de hands-on tempo, com pouca necessidade de equipamento especializado ou caro.
O protocolo passo-a-passo é seguir como uma versão modificada do protocolo do fabricante. 21 Por favor, consulte a Tabela de materiais / equipamentos de reagentes específicos, equipamentos e fabricantes.
Para a extracção bem sucedida de DNA e RNA a partir de regiões de tecido de interesse, de descaroçamento precisas é crítica. Este protocolo descreve a utilização de um punção de tecidos para isolar núcleos de 0,6 mm de diâmetro e descreve o processo de transferência de lâminas de microscópio notações para blocos FFPET correspondente. Modificações com o protocolo do fabricante foram necessária para extrair eficientemente os ácidos nucleicos a partir de núcleos, que são cerca de 50 vezes mais espessas do que as secções de micrótomo para que o protocolo foi pretendidos. Uma vez que os núcleos podem conter mais de cera de parafina em relação a cortes de tecido, desparafinização eficaz de núcleos através de passos xileno e tratamento de etanol repetidas foram necessários. O sucesso das etapas de pós-desparafinização dependia adequada mecânica núcleos de tecido homogeneização e proteinase eficiente digestão K. Além disso optimização da digestão com proteinase K pode ser realizado.
Vale ressaltar que este método identiFIES áreas de interesse sobre a superfície do bloco, tal como identificadas em lâminas de histopatologia correspondente. Como o tecido colheitas principais que podem ser de 3 ou 4 mm de profundidade, os usuários deste protocolo pode estar preocupado com o que as células ou tecidos jazia sob a superfície do bloco. Embora esta seja uma preocupação válida, vários estudos (revistos em referência 27) demonstraram que os núcleos de tecido representam fielmente o histológica e características moleculares dos blocos de tecido patológico, especialmente quando duplicado ou triplicado núcleos são provenientes da área de interesse.
À medida que o kit de extracção comercial modificado adoptada neste protocolo permite a extracção simultânea de DNA e RNA a partir do mesmo tecido, o protocolo economiza material biológico precioso e permite uma comparação directa entre os dois ácidos nucleicos resultantes da mesma amostra. extração simultânea de RNA e DNA reduz trabalho e tecido exaustão pela metade, e permite a análise integrada precisa de expr geneESSÃO, bem como características epigenética e genéticas encontradas no DNA. Uma vez que os teores de ambos ARN e ADN a partir destes núcleos de tecido representativo tipicamente superior a 600 e 300 ng, respectivamente, e uma vez que a maioria das aplicações de PCR e sequenciação próxima geração de correntes requerem tipicamente 10-100 ng, a maioria das amostras purificadas por este protocolo deve fornecer adequada material para vários ensaios a jusante. Este protocolo foi mostrado para ser reprodutível entre laboratórios independentes (Selvarajah et ai., Na Prep.). RNA a partir deste protocolo era de qualidade suficiente para a análise da expressão gênica usando RT-PCR ou uma plataforma multianalitos popular, e DNA bom desempenho em ensaios de PCR específicos de metilação. Futuros estudos que visam avaliar a utilidade de ácidos nucleicos recuperados em próxima geração seqüenciamento são garantidos.
Assim, várias modificações foram feitas para um protocolo disponível no mercado, projetado para seções FFPET finas, tornando-o adequado for o co-extracção de ARN e ADN de núcleos FFPET 0,6 mm. O protocolo consistentemente demonstrado altos rendimentos em um grande grupo de amostras de câncer de próstata e em um conjunto limitado de amostras de cancros da mama, do cérebro e da bexiga. No geral, o protocolo deve permitir que os utilizadores efectuem análises baseadas em genes-alvo de grandes coleções de tecidos bem anotados. É importante ressaltar que o protocolo permite eficiente de amostragem focalizado de regiões de interesse em FFPET, relativamente poucos hands-on tempo, e os rendimentos suficientemente altos para a maioria das aplicações a jusante.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |