Denne modificerede udvinding protokol forbedrer RNA og DNA udbytter fra mere præcist målrettede områder af interesse i histopatologiske væv blokke.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
Genomisk biomarkør forskning søger at identificere molekylære korrelater, som præcist og pålideligt afspejler sygdomsstatus, og gøre det i en klinisk anvendelig måde. 1 Biomarkør udvikling er afhængig af retrospektiv analyse af godt kommenterede vævsprøver. Syge og normale vævsprøver opbevares enten som frisk frosset væv i specialiserede biobanker eller som formalin-fikseret paraffinindlejret væv (FFPET) blokke i kliniske arkiver. Frisk frosset væv giver mulighed for udvinding af høj kvalitet nukleinsyrer og har været meget anvendt i genomiske biomarkør opdagelse studier. 2,3 Men færre vævsprøver fås i biobanker og studere sådant væv introducerer en bias i retning af større prøver, usædvanlige kategorier af sygdom, og patienter ses på specialiserede centre med større evner til bank væv. 4 FFPET derimod er standard opbevaring metode til syge mennesker og dyr væv. Mens FFPET blokke opretholde cellulær morphology optagelsen proces tværbindinger andre cellulære bestanddele til nukleinsyrer. Tværbundet RNA og DNA, kan erstattes, men kun i beskadigede, stærkt fragmenterede former. 5,6 Disse DNA- og RNA-fragmenter er, modtagelige for analyse ved en ekspanderende række af assays, herunder mRNA-ekspression, DNA hypermethylering, og målrettet sekventering. 7,8 for at udnytte denne mulighed i den store mængde og variation af FFPET rådighed for forskning, er der behov for en effektiv og pålidelig udvinding protokol.
En stor del af biomarkør forskning i væv fokuserer på cancer. Ligesom andre typer af sygt væv, kræftvæv viser ofte betydelige regionale heterogenitet i celle bevaring og celletype. Da biomarkør forskning er afhængig af evnen til at korrelere bestanddele af sygt væv med molekylære funktioner, et kritisk trin i denne proces er den præcise høst af væv, er velbevaret og beriget for disease under undersøgelse. I FFPET er to berigelse teknikker ofte brugt: laser capture mikrodissektion (LCM), og mikrotom sektionering. LCM muliggør meget fokuseret vævshøst og kan anvendes til at isolere specifikke, velbevarede celletyper i heterogene væv. 9,10 LCM kræver dog, dyrt udstyr og er uoverkommeligt tidskrævende for et stort antal prøver. Mikrotom sektionering er en mere udbredt proces, hvor tynde sektioner skæres fra FFPET blokke. 11,12 mikrotom-cut sektioner indeholder ofte væv, der er heterogen i celle konservering (f.eks nekrotisk vs. velbevaret) og sammensætning (fx kræft vs godartet parenchym), og dermed kan føre til homogenisering af molekylære funktioner bedst undersøgt separat. Således er der et behov for en high throughput metode, der beriger for celler af interesse. En tredje fremgangsmåde, isolering af nukleinsyrer fra FFPET kerner, tilvejebringer denne tilsætning, er egnet til høj throughput protokoller, og har været anvendt af andre til at isolere RNA eller DNA fra separate vævskerner. 7,13,14
En række offentliggjorte protokoller angiver fremgangsmåder til ekstraktion af nukleinsyrer fra FFPET (tabel 1). Imidlertid har protokoller hvor RNA og DNA er ekstraheret fra det samme væv blevet optimeret til mikrotomknive vævssnit, men ikke for væv kerner. 15,16 Tilsvarende offentliggjorte protokoller, der tilbyder øget vævsspecificitet, enten gennem væv fyldning eller slide microdissections, angiver procedurer til ekstraktion af DNA, men ikke RNA. 7,17 Her en optimeret protokol til dobbelt ekstraktion af både DNA og RNA fra det samme væv kerne påvises. Tissue kerner høstes ved at indsætte væv microarray (TMA) slag i regioner af interesse kortlagt på FFPET blokke. Kortlægningen udføres ved udfyldelse af et objektglas med en tusch og overføre annotation til overfladen af det tilsvarende FFPET-blok (figur 1).
Tidligere arbejde, der førte til udviklingen af denne protokol omfattede en sammenligning af flere kommercielt tilgængelige nukleinsyre udsugningsanlæg. I denne sammenligning modifikationer kommercielle protokoller, som beskrevet nedenfor tilvejebragt de højeste DNA- og RNA udbyttet og kvaliteten (Selvarajah et al., In prep). Vævskerner er tykkere end 5-10 um micron sektioner typisk anvendes i FFPET ekstraktionsprotokoller 11,12,14,18 – 20, og kan indeholde mere variable mængder af paraffin. For at kompensere for dette, blev afparaffinering forstærket ved at gentage xylen og ethanol behandlinger og ved at indføre en motoriseret homogeniseringstrin (figur 1). Endvidere blev proteinase K-fordøjelse gange forlænget for at øge DNA udbytte. Samlet set er denne protokol er omkostningseffektiv og muliggør etablering af forbindelser mellem molekylære og histopatologiske træk af sygdom i laRGE, godt karakteriserede populationer. Protokollen i sin helhed kan gennemføres pålideligt inden for 2 dage, herunder 3 timer af hands-on tid, med lille behov for specialiseret eller dyrt udstyr.
Trin-for-trin-protokollen er herefter som en modificeret version af producentens protokol. 21 Se Tabel Materialer / Udstyr til specifikke reagenser, udstyr og producenter.
For vellykkede ekstraktion af DNA og RNA fra væv regioner af interesse, nøjagtig udkerning er kritisk. Denne protokol beskriver anvendelsen af et væv patrice til isolering 0,6 mm diameter kerner og beskriver processen til overførsel notationer fra objektglas til tilsvarende FFPET blokke. Modifikationer fabrikantens protokol skulle effektivt ekstrahere nukleinsyrer fra kerner, som er ca. 50 gange tykkere end mikrotomen afsnit, for hvilke protokollen var hensigten. Da kernerne kan indeholde mere paraffin forhold til vævssnit, effektiv afparaffinering af kerner gennem gentagne xylen og ethanol behandlingstrin var påkrævet. Succesen af de post-Afparaffinering trin afhang ordentlig mekanisk væv kerner homogenisering og effektiv proteinase K-fordøjelse. kan udføres yderligere optimering af proteinase K-fordøjelse.
Det er værd at nævne, at denne metode identiFIES områder af interesse på overfladen af blokken, som er identificeret i tilsvarende histopatologi dias. Som centrale høst væv, der kan være 3 eller 4 mm dyb, kan brugere af denne protokol være bekymret over, hvad celler eller væv lå under blokken overflade. Selvom dette er en velbegrundet bekymring, har flere undersøgelser (anmeldt i henvisning 27) viste, at væv kerner korrekt billede af den histologiske og molekylære egenskaber af patologiske væv blokke, især når dobbelt eller tredobbelt kerner udtages fra området af interesse.
Som det modificerede kommercielle ekstraktion kit vedtaget i denne protokol muliggør samtidig ekstraktion af både DNA og RNA fra det samme væv, protokollen sparer kostbar biologisk materiale og tillader en direkte sammenligning mellem de to resulterende nukleinsyrer fra den samme prøve. Samtidig ekstraktion af RNA og DNA skærer ned arbejdskraft og væv udtynding halve, og muliggør præcis integreret analyse af gen-expression, samt epigenetiske og genetiske funktioner, der findes i DNA. Da udbyttet af både RNA og DNA fra disse repræsentative væv kerner typisk overstige 600 og 300 ng henholdsvis, og siden de fleste nuværende PCR og næste generation sekventering applikationer kræver typisk 10-100 ng, bør de fleste af prøverne oprenses ved denne protokol giver tilstrækkelig materiale til flere downstream assays. Denne protokol er blevet vist at være reproducerbar tværs uafhængige laboratorier (Selvarajah et al., In prep.). RNA fra denne protokol var af tilstrækkelig kvalitet til genekspression analyse ved hjælp af enten RT-PCR eller en populær multianalyte platform, og DNA klaret sig godt i methylering specifikke PCR-analyser. Fremtidige undersøgelser med henblik på at vurdere nytten af genvundne nukleinsyrer i næste generation sekventering er berettiget.
Således blev flere ændringer foretaget til en kommercielt tilgængelig protokol, der er designet til tynde FFPET sektioner, hvilket gør den velegnet for co-ekstraktion af RNA og DNA fra 0,6 mm FFPET kerner. Protokollen demonstrerede konsekvent høje udbytter i en stor gruppe af prostatacancer prøver og i et begrænset sæt af prøver fra bryst-, hjerne og blære. Alt i alt bør protokollen gør det muligt for brugerne at foretage målrettede genbaserede analyser af store godt annoterede væv samlinger. Vigtigt er det, protokollen muliggør effektiv fokuseret sampling af områder af interesse i FFPET, relativt små hands-on tid, og høje nok udbytter for de fleste efterfølgende anvendelser.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |