SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Joerg Nikolaus; Erdem Karatekin

doi:10.3791/54349

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neuroscienze

فيوجن بوساطة كمين لواحدة Proteoliposomes مع طبقات ثنائية المدعومة المربوطة في خلية ميكروفلويديك تدفق رصدت من قبل المستقطبة TIRF المجهري

Published: August 24, 2016

doi:

10.3791/54349

Joerg Nikolaus², Erdem Karatekin^2,3,4

¹Department of Cellular and Molecular Physiology,Yale University School of Medicine, ²Nanobiology Institute,Yale University, ³Department of Molecular Biophysics and Biochemistry,Yale University, ⁴Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales,Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

Summary

هنا، نقدم بروتوكول للكشف، والأحداث الانصهار واحدة بوساطة كمين بين الجسيمات الشحمية وطبقات ثنائية معتمدة في قنوات ميكروفلويديك باستخدام TIRFM الاستقطاب، مع حساسية جزيء واحد و~ 15 مللي ثانية قرار الوقت. ويمكن الكشف عن الدهون والافراج عن البضائع القابلة للذوبان في وقت واحد. يتم قياس حجم الجسيمات الشحمية، الانتشارية الدهون، والمسام الانصهار خصائص.

Abstract

في عملية في كل مكان من الانصهار غشاء فتح المسام الانصهار يؤسس أول اتصال بين اثنين من مقصورات منفصلة سابقا. خلال العصبي أو إطلاق هرمون عبر إيماس، يمكن للمسام الانصهار مفتوحة عابر وعلى مقربة مرارا وتكرارا، وتنظيم البضائع إطلاق حركية. ديناميات المسام أيضا تحديد طريقة إعادة التدوير الحويصلة. نتائج إعادة عزل لا رجعة فيها في عابرة الانصهار، "تقبيل والفر"، في حين أن تمدد يؤدي إلى الانصهار الكامل. من أجل فهم أفضل ما هي العوامل التي تحكم ديناميات المسام، وضعنا مقايسة لمراقبة الانصهار غشاء باستخدام الاستقطاب الانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري مع حساسية جزيء واحد و~ 15 قرار الوقت مللي ثانية في كيميائيا واضحة المعالم في نظام المختبر. الانصهار وصفت من fluorescently الحويصلات unilamellar صغيرة تحتوي على البروتينات الخامس الفخ (الخامس سيارات الدفع الرباعي) مع مستو طبقة ثنائية تحمل تي الافخاخ، معتمدة على وسادة لينة البوليمر (تي سيمبول تكنولوجيز، التي تدعمها ر طبقة ثنائية)، ورصدها. يستخدم فحص قنوات تدفق الموائع الدقيقة التي تضمن الحد الأدنى من استهلاك عينة في حين تزويد كثافة ثابتة من سيارات الدفع الرباعي. استغلال تعزيز إشارة السريع على نقل بطاقات الدهون من سيارات الدفع الرباعي إلى SBL خلال الانصهار، ويتم رصد حركية نقل الدهون صبغ. حساسية TIRF المجهري يسمح تتبع العلامات الدهون الفلورسنت واحدة، والتي من الانتشارية الدهون وحجم الدفع الرباعي يمكن استخلاصه لكل حدث الانصهار. الدهون مرات الإفراج صبغة يمكن أن تكون أطول بكثير مما كان متوقعا للمرور دون عوائق من خلال المسام مفتوحة بشكل دائم. باستخدام نموذج يفترض يرجع إلى المسام الخفقان التخلف الإفراج الدهون، المسام "الانفتاح"، وجزء من الوقت تبقى المسام مفتوحة خلال الانصهار، يمكن تقدير. وعلامة القابلة للذوبان يمكن أن تكون مغلفة في سيارات الدفع الرباعي لرصد وقت واحد من الدهون والإفراج البضائع القابلة للذوبان. وتشير هذه القياسات بعض المسام قد ختم بعد فقدان جزء من البضائع القابلة للذوبان.

Introduction

الانصهار الغشاء هو عملية بيولوجية عالمية المطلوبة للاتجار داخل الخلايا من الدهون والبروتينات، إفراز، والتسميد، والتنمية، ويلفها دخول الفيروس إلى الكائنات المضيفة ^1-3. بالنسبة لمعظم تفاعلات الاندماج داخل الخلايا بما في ذلك الإفراج عن الهرمونات والناقلات العصبية عبر إيماس، يتم توفير الطاقة لدمج اثنين من طبقات ثنائية الدهون عن طريق تشكيل لحزمة أربعة الحلزون بين (الفخ) البروتينات وما شابه ذلك للذوبان N-ethylmaleimide تراعي بروتين عامل مرفق مستقبلات، الراسية في الحويصلة (الخامس الفخ) والغشاء الهدف (تي الفخ) ⁴ على التوالي. متشابك الحويصلة إيماس هو تفاعل الاندماج أكثر ينظم بإحكام ويحدث خلال ميلي ثانية واحدة بعد وصول ^ل1،4،5 المحتملين عمل. المسام الانصهار، الاتصال الأولي بين اثنين من الصمامات مقصورات، يمكن أن تومض مفتوحة ومغلقة عدة مرات قبل إعادة طبع أو توسيع بصورة لا رجعة فيها ^5-7. النتائج السابقةفي عابرة، "قبلة وتشغيل" الانصهار، في حين يؤدي الأخيرة إلى الانصهار الكامل. العوامل التي تحكم التوازن بين هذين الوضعين الانصهار وآليات تنظيم المسام الخفقان ليست مفهومة جيدا ^5،8.

مطلوبة البروتينات كمين لإيماس. وألغت متشابك الانصهار الحويصلة على الانقسام من الافخاخ التي كتبها أعصاب ^9. وأظهرت التجارب الانصهار السائبة باستخدام الحويصلات unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) أن الافخاخ ليست مطلوبة فقط، ولكن أيضا ما يكفي لدفع الغشاء الانصهار ^10. في هذا الاختبار بكميات كبيرة، وسيارات الدفع الرباعي أعادت مع الخامس الافخاخ (الخامس SUV) ومخدر مع الفوسفورية الفلورسنت (N – (7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazol-4-YL) -phosphoethanolamine (NBD-PE) و ( N – (lissamine رودامين B السلفونيل) -phosphoethanolamine (LR-PE) ويخلط مع حويصلات غير المسماة التي تحتوي على تي الافخاخ (ر-SUV) في البداية مضان بنك دبي الوطني-PE في الخامس سيارات الدفع الرباعي ومروي التي كتبها فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق ) إلى LR-PE. كما مختبرالهنداوي الخامس سيارات الدفع الرباعي تلتحم مع غير المسماة تي سيارات الدفع الرباعي، يتم تقليل كثافة سطح fluorophore في الغشاء الآن جنبا إلى جنب، والزيادة الناتجة في دبي الوطني-PE مضان تقارير مدى الدهون خلط ^10. كما فحص الجزء الأكبر من السهل إعداد وتحليل، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لدراسة آليات بوساطة كمين الانصهار ^10-14. ومع ذلك، لديها العديد من القيود، مثل انخفاض حساسية وضعف قرار الوقت. الأهم من ذلك، باعتبارها قياس الفرقة، فإنه المتوسطات النتائج على كل الأحداث مما يجعل التمييز بين الالتحام والانصهار، وكذلك الكشف عن وسيطة hemifusion الصعبة.

وعلى مدى عدة مجموعات العقد الماضي، بما في ذلك بلدنا، وضعت فحوصات جديدة لرصد الأحداث الانصهار في مستوى حويصلة واحدة ^15-27. تستخدم ها وزملاؤه الخامس سيارات الدفع الرباعي المربوطة على سطح ومراقبة الانصهار مع حرية تي سيارات الدفع الرباعي ^18،19. تم رصد الدهون خلط باستخدام الحنق بين زوج من fluorophores محددة الدهون مسريرا في الخامس وتي سيارات الدفع الرباعي، على التوالي، وذلك باستخدام الانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري ^18. وفي وقت لاحق، استخدم مختبر Brunger من نوع دهون، تسمية واحدة جنبا إلى جنب مع علامة محتويات للكشف في وقت واحد من الدهون ومحتويات خلط ^20،28. وشملت كلا من الدهون وعلامات محتويات في ارتفاع، تركيزات التبريد الذاتي. أدى اندماج مع سيارات الدفع الرباعي غير المسماة في مضان dequenching ^20،28.

وتنصهر الآخرين الخامس سيارات الدفع الرباعي إلى طبقات ثنائية مستو تشكيلها مع تي الافخاخ ^{15-17،21-27،29.} الهندسة المستوية من الهدف (تي فخ الحاوي) يحاكي أفضل طبقة ثنائية عملية الانصهار الفسيولوجية، الحويصلات المنحنية للغاية صغيرة مع غشاء البلازما المسطحة. مجموعة ستاينم المستخدمة الأغشية التي تغطي المسام تشكيلها مع تي الافخاخ، علقت اكثر من مسامية الركيزة نيتريد السيليكون والكشف عن الانصهار مع الفردية-سيارات الدفع الرباعي ضد استخدام ليزر متحد البؤر المسح المجهري ^23. الآخرين وتستخدم الخامس سيارات الدفع الرباعي إلى طبقات ثنائية مستو تشكيلها مع تي الافخاخ، معتمد على ركيزة الزجاج ^{15-17،21،22،24-27،29.} ميزة كبيرة لاستخدام طبقات ثنائية المدعومة (SBLs) هي أن TIRF المجهري يمكن استخدامها للكشف عن الالتحام والانصهار الأحداث مع ممتازة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ودون تدخل من الخامس سيارات الدفع الرباعي الحرة، على الرغم من استخدام على microfluidics يوفر الدقة حدث واحد باستخدام معيار بعيدة الميدان epifluorescence المجهري ^24.

ومصدر القلق الرئيسي هو ما إذا كان وكيف التفاعلات الركيزة طبقة ثنائية تؤثر دعم جودة طبقة ثنائية وعملية الاندماج. تقدم العمل في وقت مبكر استخدام SBLs مستو التي تم دعمها مباشرة على الزجاج أو الكوارتز الركيزة ^15-17. وقدمت هذه SBLs عن طريق الامتزاز، انفجار، ونشر والانصهار الأغشية تي سيارات الدفع الرباعي على الركيزة. وقد أدرك ذلك قريبا، مع ذلك، أن حذف عنصر تي كمين رئيسي، SNAP25، من SBLs أعد بهذه الطريقة أدى إلى الخامس SUV الالتحام والانصهار حركية indistinguishable من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام كامل تي الافخاخ ^17. لأنه مطلوب SNAP25 تماما عن الانصهار في الجسم الحي ^30،31، وضعت أهمية فسيولوجية من هذه المحاولات المبكرة موضع تساؤل. تغلبت مجموعة تام لهذا التحدي باستخدام تشكيل طبقة ثنائية الخاضعة لسيطرة دعم أفضل ^21. وهي تستخدم انجميور-بلودجيت ترسب على النشرة الأولى خالية من البروتين من سيمبول تكنولوجيز، تليها انصهار أن أحادي الطبقة مع تي سيارات الدفع الرباعي ^21. وأدى ذلك إلى الانصهار تعتمد-SNAP25.

لتجنب القطع الأثرية المحتملة المرتبطة طبقة ثنائية المدعومة مباشرة على ركيزة الزجاج دون الحاجة إلى استخدام أساليب انجميور-بلودجيت، Karatekin وآخرون قدم، بولي رطب (جلايكول الإثيلين) (PEG) وسادة لينة بين طبقة ثنائية والركيزة ^24. أدى هذا التعديل أيضا في تعتمد-SNAP25 الانصهار ^24. قد طبقات ثنائية خففت على طبقة البوليمر لينة من المعروف للحفاظ على الغشاء أفضلاستخدمت التنقل البروتين وظيفة ^32، والدراسات الانصهار مع الفيروسات ^33. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن طبقات ثنائية مضاد للفيروسات للاحتفاظ بعض القدرة في تقرير المصير، شفاء وهي قوية جدا ^34،35. أولا، واشتملت على جزء من المتاحة تجاريا سلاسل PEG، مرتبطة الدهون في غشاء تي سيارات الدفع الرباعي. عندما انفجرت هذه تي سيارات الدفع الرباعي وتشكل طبقة ثنائية مستو على ركيزة الزجاج وفرشاة PEG تغطي كلا منشورات من طبقة ثنائية مستو. لأنه هو الدافع وراء تشكيل مستو طبقة ثنائية الإذعان لسلاسل PEG المحيطة تي سيارات الدفع الرباعي على سطح الزجاج ماء، انفجار الحويصلية وتشكيل طبقة ثنائية مستو لا تعير اهتماما نسبيا لتكوين الدهون المستخدمة. ومع ذلك، عندما يتم إدراج كميات كبيرة من الكوليسترول في الدم، وزيادة خصائص متماسكة من سيارات الدفع الرباعي، وسيارات الدفع الرباعي قد لا تنفجر من تلقاء أنفسهم. إذا كان هذا هو الحال، ناضح صدمة أو ثنائي التكافؤ أيونات يمكن استخدامها للمساعدة على مستو تشكيل طبقة ثنائية ^25.

وكما ذكر أعلاه، في هذه ا ف باملنهجية فرشاة PEG تغطي جانبي مستو، بدعم طبقة ثنائية. الفرشاة التي تواجه قناة تدفق الموائع الدقيقة يساعد على منع التصاق غير محددة من واردة الخامس سيارات الدفع الرباعي التي هي أيضا تغطيها عادة مع طبقة الربط. تشكيل المجمعات الخامس وتي كمين يبدأ من N-ترميني غشاء القاصي والعائدات في مراحل نحو المجالات غشاء الداني ^36. ل-سيارات الدفع الرباعي الخامس للتفاعل مع تي سيمبول تكنولوجيز، والخامس والحاجة تي فخ N-تيرميني لتبرز فوق فرش PEG، والذي يبدو أن هذا هو الحال في ظل ظروف الفحص. يمكن تكييفها ارتفاع فرشاة لدراسة البروتينات الأخرى من الافخاخ من خلال تغيير كثافة من الدهون مضاد للفيروسات وPEG طول سلسلة ^37،38. فائدة أخرى من فرش PEG تغطي الأسطح القريبة من طبقات ثنائية الصمامات هي أنها تحاكي بيئة مزدحمة من الأغشية الحيوية التي تكتظ 30،000-40،000 بروتينات الغشاء لا يتجزأ لكل متر مربع ميكرون ^39. تماما مثل سلاسل PEG في هذا الاختبار، وREPUطبقة البروتين lsive تغطي الأغشية البيولوجية يجب أن تكون دفعت جانبا للسماح للاتصال بين اثنين من طبقات ثنائية فوسفورية للانصهار تحدث.

تستخدم قنوات تدفق الموائع الدقيقة في هذا الاختبار، كما أنها توفر مزايا فريدة من نوعها. أولا، تدفق ميكروفلويديك يتيح المزيد من ترسب موحد للتي سيارات الدفع الرباعي لنشر والصمامات لتشكيل تي SBL. الثانية، وحجم قناة صغيرة (<1 ميكرولتر) يقلل من استهلاك عينة. ثالثا، كميات صغيرة المطلوبة تسمح التجربة بأكملها التي ستجرى تحت تدفق مستمر. تدفق يزيل ضعيفة، ويفترض غير تحديدا، الالتزام الخامس سيارات الدفع الرباعي من SBL ^16. كما يقيم كثافة ثابتة من الخامس سيارات الدفع الرباعي فوق تي سيمبول تكنولوجيز، وتبسيط التحليل الحركي ^17. وأخيرا، وتتميز الحويصلات رست بسهولة من تلك الخطوط التي يحملها تدفق ^25. الرابعة، وعدة قنوات ميكروفلويديك يمكن استخدامها على نفس ساترة، كل يحققون في حالة مختلفة. وهذا يسمح مقارنة الظروف الدورينانوغرام نفس العملية التجريبية. وقد استخدم نهج مماثل من قبل مجموعة فان Oijen لدراسة الاندماج بين فيروس الإنفلونزا، وSBLs خففت ^33.

في TIRF المجهري، واضمحلال الأسي الحقل زائل (مع التحلل ثابت ~ 100 نانومتر) حدود مضان الإثارة إلى تلك الجزيئات التي هي في مكان قريب جدا من واجهة زجاجية عازلة. هذا يقلل من مساهمة جزيئات الفلورسنت التي هي أبعد، ويزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ويتيح حساسية جزيء واحدة مع أوقات التعرض إطار 10-40 مللي ثانية. يؤدي مجال زائل أيضا إلى زيادة إشارة على الانصهار: كما نقل الدهون وصفت من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز، وجدوا أنفسهم، في المتوسط، في حقل الإثارة أقوى. هذه الزيادة في مضان أقوى لالجسيمات الشحمية أكبر.

إذا تم استخدام الضوء المستقطب لتوليد مجال زائل، تساهم آثار إضافية للتغيرات في مضان على رransfer من التسميات من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز. بعض الأصباغ الدهون لديها ثنائي القطب الانتقال الموجهة بزاوية متوسط يفضل فيما يتعلق طبقة ثنائية التي هي جزء لا يتجزأ منها. وهذا يخلق فرقا في مقدار مضان المنبعثة من fluorophores عندما يكونون في سيارات الدفع الرباعي مقابل SBL، لأن شعاع الاستقطاب سوف تثير الأصباغ في الأغشية اثنين بشكل مختلف. عن السابق، فإن شعاع الإثارة التفاعل مع ثنائيات الاقطاب الانتقال الموجهة نحو سيارات الدفع الرباعي كروية، في حين أن لهذا الأخير، وسوف تقتصر توجهات ثنائي القطب من قبل هندسة SBL مسطحة. على سبيل المثال، عند استخدام الصورة مستقطب الضوء الساقط (الاستقطاب وضعها الطبيعي لطائرة من الإصابة)، الإثارة أكثر كفاءة عندما الصبغة هي في SBL من في سيارات الدفع الرباعي لمواز الموجهة الدهون صبغ انتقال ثنائي القطب لغشاء ^29،40 (مثل تلك التي الجاذبة أو لم ^41-43). يظهر SUV مخدر مع مثل هذه fluorophore خافت عندما الاحواض على سيمبول تكنولوجيز (الشكل 7، Representat إيف نتائج). كما يفتح المسام الانصهار ويربط الأغشية سيارات الدفع الرباعي وSBL، تحقيقات الفلورسنت منتشر في SBL وتصبح أكثر عرضة للولع مجال زائل الاستقطاب يالي ^25،27،29. وبالتالي، فإن إشارة مضان متكاملة حول الموقع الانصهار يزيد بشكل حاد خلال نقل الصبغة من سيارات الدفع الرباعي في SBL ²⁷ (الشكل 3) والشكل (7). عاملا إضافيا يسهم في إشارة التغييرات التي ترافق الاندماج وdequenching من العلامات الفلورية كما هي المخفف أنها عندما نقل إلى SBL. مساهمة dequenching عادة طفيفة مقارنة آثار تسوس الميدانية والاستقطاب زائل في مقايسة الموصوفة هنا، لأنه فقط جزء صغير ( ) من الدهون وصفت.

الزيادة إشارة على الانصهار يمكن استغلالها لاستخلاص الخصائص الانصهار المسام بمقارنة ذلك الوقت،1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>، المطلوبة للدهون للهروب من خلال المسام التي هي قابلة للاختراق بحرية إلى الدهون إلى الافراج عن الوقت الفعلي، . إذا جداول مرتين قابلة للمقارنة، ستكون النتيجة هي أن المسام يعرض مقاومة تذكر لتدفق الدهون. ومع ذلك، إذا كان الافراج عن الوقت الفعلي هو أطول بكثير من الوقت لاطلاق سراح محدودة الانتشار، وهذا من شأنه أن يشير إلى عملية، مثل الخفقان المسام، وتأخير الافراج عن الدهون. الافراج عن الوقت محدودة الانتشار، ، ويعتمد على حجم الجسيمات الشحمية الصمامات ودهون، الانتشارية. يتطلب تقديراتها هذه المعلمتين ليكون كميا. حساسية جزيء واحد من الفحص تسمح الانتشارية الدهون المراد قياسها من خلال تتبع عدة fluorophores الدهون واحد بعد إطلاق سراحهم في SBL لكل حدث الانصهار ^26. حجم كل حويصلة الصماماتويمكن تقدير ²⁷ عن طريق الجمع بين (ط) شدة صبغة الدهون واحد، (ب) التغير في مضان الكلي حول موقع رسو السفن بعد أن يتم نقل جميع fluorophores في سيمبول تكنولوجيز على الانصهار، (ج) المعروفة كثافة العلامات على سيارات الدفع الرباعي الدهون، و (د) من منطقة في الدهون. بالنسبة لكثير من الأحداث الانصهار، تم العثور على الأوقات الافراج عن الدهون الفعلية لتكون أبطأ بكثير مما كان متوقعا من قبل تحت سيطرة نشر الافراج عن ^27، كما لوحظ سابقا على افتراض حجم SUV موحد ^44. على افتراض التخلف الإفراج الدهون ومن المقرر أن المسام الخفقان، وهذا نموذج كمي يسمح تقدير "انفتاح المسام"، جزء من الوقت تبقى المسام مفتوحة أثناء الانصهار ^27.

كلما كان ذلك عمليا، فمن المهم لاختبار آليات الاندماج باستخدام كل من الدهون ومحتويات بطاقات القابلة للذوبان. على سبيل المثال، يمكن أن يؤخر الإفراج الدهون من خلال عمليات أخرى من الخفقان المسام، مثل تقييد انتشار الدهون من البروتينات الفخ الذي تحيط رانه المسام. إذا كانت هذه هي الحالة، ثم الإفراج عن محتويات سيسبق الإفراج عن تسميات الدهون، شريطة المسام كبيرة بما فيه الكفاية للسماح بمرور تحقيقات القابلة للذوبان. خلل أكثر أساسيا في نهج يمكن أن يكون في افتراض أن نقل الدهون المسمى إلى SBL يحدث من خلال المسام الانصهار الضيق الذي يربط بين SBL إلى الحويصلة التي احتفظت إلى حد كبير شكل قبل الانصهار. يمكن نقل الدهون في SBL ايضا ان ينتج من اتساع السريع للمسام الانصهار مع ما يصاحب ذلك، غاية الانهيار السريع من سيارات الدفع الرباعي في غشاء سيمبول تكنولوجيز، كما سبق واقترح بناء على بيانات الافراج عن الدهون وحدها ^29. رصد كل الدهون ومحتويات الافراج في وقت واحد، فقد وجد أن العديد من المسام أعادت بعد إطلاق سراح جميع العلامات الدهون، ولكن احتفظت ببعض البضائع القابلة للذوبان من ^27. هذا يدل على أن بعض الجسيمات الشحمية لا ينهار على الأقل في SBL بعد الانصهار، والتي نقل الدهون الصبغة في SBL يحدث من خلال المسام الانصهار. وبالإضافة إلى ذلك، لحدث IPID ومحتويات الافراج في وقت واحد ^27، مما يجعل من غير المرجح أن تخلف الإفراج الدهون يرجع إلى إعاقة انتشار الدهون من البروتينات كمين المحيطة المسام ^45.

بروتوكول الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL التي لم ترصد إطلاق محتويات قابلة للذوبان ونشرت من قبل Karatekin وروثمان ^25. هنا، يتم تضمينها المزيد من التطورات الأخيرة، ورصد أي وقت واحد من الدهون والافراج عن محتويات وتقدير خصائص سيارات الدفع الرباعي، الدهون، والانصهار المسام ^27. يبدأ البروتوكول مع تعليمات لإعداد الخلايا الموائع الدقيقة، التي تربط بولي (ميثيل siloxane) (PDMS) المطاط الصناعي كتلة تحتوي على أخاديد مع ساترة زجاج ^25. بعد ذلك، يتم شرح إعداد الخامس سيارات الدفع الرباعي مع كل من الدهون ومحتويات علامات. القسمين 4 و 5 توفر تعليمات لتجميع الخلايا الموائع الدقيقة، وتشكيل SBLs في الموقع والتحقق من وجود عيوب وسيولة، وإدخال VSأوفس في تدفق الخلايا والكشف عن الأحداث الانصهار. ويقدم القسم 6 تعليمات لتحليل البيانات.

Protocol

1. إعداد كتلة PDMS لتشكيل قناة ميكروفلويديك الشكل 1. التصنيع الدقيق من قالب خلية تدفق وإعداد كتلة PDMS. (A) تصميم خلية تدفق أربع قنوات التي تناسبها على الزجاج ساترة 24 × 60 ?…

Representative Results

الجودة SBL ومن الأهمية بمكان للتحقق من جودة وسيولة من سيمبول تكنولوجيز قبل التجربة الانصهار. يجب أن يكون مضان في الجانب السفلي، والزجاج من قناة ميكروفلويديك موحد، من دون أي عيوب واض…

Discussion

التنفيذ الناجح لفحص الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL الموصوفة هنا يعتمد بشكل كبير على عدة خطوات رئيسية، مثل إعادة الوظيفية للبروتينات إلى الجسيمات الشحمية، الحصول على SBLs ذات نوعية جيدة، واختيار المعلمات التصوير الصحيحة للكشف عن جزيئات واحدة. على الرغم من أنه قد يست…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O’Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.

Materials

Reagents
Milli-Q (MQ) water	Millipore
KOH	J.T. Baker	3040-05
Ethanol 190 Proof	Decon
Isopropanol	Fisher Chemical	A416P4
HEPES	AmericanBio	AB00892
Sodium Cholride (KCl)		AB01915
Dithiothreitol		AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	AmericanBio	AB00892
EGTA	Acros Organics	409911000

Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4)			25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT

Solvents
Chloroform	J.T. Baker	9180-01	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol	J.T. Baker	9070-03	in glass bottle, CAUTION, wear PPE

Liposome preparation
Gastight Hamilton syringe	Hamilton	var. sizes	only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)	http://www.hamiltoncompany.com
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16×100 mm screw cap culture tube	Pyrex	70825-16	clean thoroughly, rinse with chloroform	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457	Lipids come dissolved in CHCl₃ or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl₃/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening	http://www.avantilipids.com/
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)		840035
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)		850804
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2		840046
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE		810145
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE		880130
cholesterol (ovine wool, >98%)		700000
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)	Molecular Probes	D-307		https://www.thermofisher.com/
Rotavapor R-210	Buchi	R-210	heat bath above Tm of lipids used	http://www.buchi.com/
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside	Affymetrix	0311	store at -20°C, let come to RT before opening	https://www.anatrace.com/
Shaker – Eppendorf Thermomixer R	Eppendorf			https://www.eppendorf.com/
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL	life technologies	66003		https://www.lifetechnologies.com/
Bio-Beads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	1523920		http://www.bio-rad.com/
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556		http://www.sigmaaldrich.com/
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	41121703		https://www.beckmancoulter.com/
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB	Molecular Probes	S-1307		https://www.thermofisher.com/
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm	Bio-Rad	7372512		http://www.bio-rad.com/
Sepharose CL-4B	GE Healthcare	17-0150-01		http://www.gelifesciences.com/
SYPRO Orange Protein Gel Stain	Molecular Probes	S-6650	5,000X Concentrate in DMSO	https://www.lifetechnologies.com/

PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS	Dow Corning	3097358-1004		http://www.dowcorning.com/
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover	Corning	3160-152		http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
Hole puncher – Reusable Biopsy Punch, 0.75mm	World Precision Instruments	504529		http://www.wpi-europe.com/
Manual Hole Punching Machine	SYNEO	MHPM-UNV		http://www.syneoco.com/
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch	SYNEO	CR0350265N20R4	drill diameter: 0.9 mm	http://www.syneoco.com/
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD	Cole-Parmer	06419-00	0.010" ID, 0.030" OD	http://www.coleparmer.com/
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD	Cole-Parmer	95802-00	0.020" ID, 0.083" OD	http://www.coleparmer.com/

Cover glass - cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D	Schott	1472305		http://www.us.schott.com/
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G		http://harrickplasma.com/

pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body	Olympus	IX81		http://www.olympus-lifescience.com/en/
EM CCD camera	Andor	ixon-ultra-897		http://www.andor.com/
Thermo Plate, heated microscope stage	Tokai Hit	MATS-U52RA26		http://www.tokaihit.com/
1 ml hamilton glass syringes (4x)	Hamilton	81365		http://www.hamiltoncompany.com
syringe pump	kd Scientific	KDS-230		http://www.kdscientific.com/

Riferimenti

Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287 (2016).
Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006 (2015).
Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109 (2012).
Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Nikolaus, J., Karatekin, E. SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (114), e54349, doi:10.3791/54349 (2016).