La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Summary

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

Abstract

En el proceso omnipresente de fusión de la membrana de la apertura de un poro de fusión establece la primera conexión entre dos compartimentos separados anteriormente. Durante neurotransmisor o la liberación de hormonas a través de la exocitosis, el poro de fusión puede abrir y cerrar transitoriamente en varias ocasiones, la regulación de la cinética de liberación de carga. la dinámica de los poros también determinan el modo de reciclaje de vesículas; resellado resultados irreversibles en la fusión transitoria, "kiss-and-run", mientras que la dilatación conduce a la fusión completa. Para entender mejor los factores que gobiernan la dinámica de los poros, hemos desarrollado un ensayo para monitorizar la fusión de membranas mediante microscopía de fluorescencia polarizada de reflexión interna total (TIRF) con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución en un bioquímicamente bien definidas sistema in vitro. La fusión etiquetada de manera fluorescente pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas v-SNARE (V-SUV) con una doble capa de apoyo plana t-SNARE, apoyado en un cojín de polímero blando (t-SBL, bicapa t-apoyado), Se controla. El ensayo utiliza canales de flujo de microfluidos que garantizan un mínimo consumo de muestra, mientras que el suministro de una densidad constante de los SUV. La explotación de la mejora rápida de la señal después de la transferencia de las etiquetas de lípidos de la SUV de la LPS durante la fusión, la cinética de la transferencia de colorantes de lípidos se controla. La sensibilidad de la microscopía TIRF permite el seguimiento de las etiquetas de lípidos fluorescentes individuales, de los cuales difusividad de lípidos y tamaño SUV se puede deducir por cada evento de fusión. Los tiempos de liberación de colorante de lípidos pueden ser mucho más de lo esperado para el paso sin obstáculos a través de los poros abiertos de forma permanente. El uso de un modelo que asume el retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo, un poro "apertura", la fracción de tiempo que el poro se mantiene abierto durante la fusión, puede ser estimado. Un marcador soluble puede ser encapsulada en los terrenos para el seguimiento simultáneo de los lípidos y la liberación de la carga soluble. Estas mediciones indican algunos poros pueden volver a cerrar después de perder una fracción de la carga soluble.

Introduction

La fusión de membranas es un proceso biológico universal, necesaria para el tráfico intracelular de lípidos y proteínas, la secreción, la fertilización, el desarrollo y la envolvió entrada del virus en organismos huésped ^1-3. Para la mayoría de las reacciones de fusión intracelular, incluida la liberación de las hormonas y los neurotransmisores a través de la exocitosis, la energía para fusionar dos bicapas lipídicas se proporciona por formación de un haz de cuatro hélices entre las proteínas N-etilmaleimida sensible receptor de la proteína factor de unión soluble cognado (SNARE), anclada en la vesícula (v-SNARE) y la membrana diana (t-SNARE) ^4, respectivamente. Sináptica exocitosis de vesículas es la reacción de fusión más estrechamente regulado y se produce dentro de una milésima de segundo después de la llegada de un potencial de acción ^1,4,5. El poro de fusión, la conexión inicial entre los dos compartimientos de fusión, puede parpadear abierto y cerrado varias veces antes de volver a sellar o expansión irreversible ^5-7. Los resultados anterioresen transitoria, "Kiss & run" de fusión, mientras que la segunda conduce a la fusión completa. Los factores que regulan el equilibrio entre estos dos modos de fusión y mecanismos que regulan el parpadeo de los poros no son bien entendidos ^5,8.

Se requieren proteínas SNARE de exocitosis; la fusión de vesículas sinápticas se suprimirán a partir de la escisión de trampas por neurotoxinas ^9. Los experimentos de fusión a granel mediante pequeñas vesículas unilaminares (SUV) mostraron que SNAREs no sólo son necesarios, sino también suficiente para impulsar la fusión de membranas ^10. En este ensayo mayor, SUVs reconstituyeron con v-SNARE (v-SUV) fueron dopados con fosfolípidos fluorescentes (N – (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) y ( N -. (lisamina rodamina B sulfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) y se mezcló con vesículas que contienen no marcados t-SNARE (t-SUV) Inicialmente la fluorescencia de NBD-PE en v-SUV se extinguió mediante la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET ) a LR-PE. Como laboratorioELED v-SUVs se fusionan con no marcados camisetas SUVs, la densidad superficial fluoróforo en la membrana ahora combinada se reduce y el incremento resultante en la fluorescencia NBD-PE informa de la extensión de los lípidos de mezcla ^10. A medida que el ensayo mayor es fácil de configurar y analizar, se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de fusión SNARE mediada ^10-14. Sin embargo, tiene varias limitaciones, tales como una baja sensibilidad y una pobre resolución de tiempo. Lo más importante, como una medición de conjunto, el promedio es los resultados de todos los acontecimientos que hacen discriminación entre acoplamiento y de fusión, así como la detección de intermedios hemifusion difíciles.

La última década varios grupos, incluido el nuestro, se han desarrollado nuevos ensayos para monitorizar los eventos de fusión a nivel de la vesícula única ^15-27. Ha y sus colegas utilizaron en V SUV atados sobre una superficie y un seguimiento de su fusión con T-SUV gratuitas ^18,19. la mezcla de lípidos se controló utilizando FRET entre un par de fluoróforos unidos a lípidos emcamas en el V y T-SUV, respectivamente, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) ^18. Más tarde, el laboratorio de Brunger utiliza una sola especie de lípidos de la etiqueta junto con un marcador de contenidos para la detección simultánea de lípidos y mezclando ^20,28. Tanto el lipídica y los marcadores de contenidos se incluyeron en altas concentraciones, auto-enfriamiento rápido; fusión con SUVs no marcados como resultado de la fluorescencia desatenuación ^20,28.

Otros han fusionado en V SUV de bicapas planas reconstituidos con t-SNARE ^{15-17,21-27,29.} La geometría planar del objetivo (t-SNARE que contiene) bicapa imita mejor el proceso de fusión fisiológica de vesículas pequeñas, muy curvadas con una membrana de plasma plana. El grupo Steinem emplea membranas de poros que abarca reconstituidos con t-SNARE, suspendidos sobre un sustrato de nitruro de silicio poroso y detecta la fusión con la V-SUV individuales mediante microscopia láser confocal de barrido ^23. otros fusadas en V SUV a bicapas planas reconstituidos con t-SNARE, soportados sobre un sustrato de vidrio ^{15-17,21,22,24-27,29.} La gran ventaja de utilizar bicapas soportadas (SBLS) es que la microscopía TIRF se puede utilizar para detectar eventos de conexión y de fusión con una excelente relación señal-ruido y sin interferencia de envío V-SUV, aunque el uso de microfluidos también proporciona una resolución de un solo evento usando -campo lejano estándar microscopía de epifluorescencia ^24.

Una preocupación importante es si y cómo las interacciones sustrato bicapa afectar a la calidad apoyados bicapa y el proceso de fusión. Los primeros trabajos hizo uso de SBLS planas que fueron apoyados directamente sobre un sustrato de vidrio o cuarzo ^15-17. Estos SBLS se hicieron por adsorción, el estallar, la difusión y la fusión de las membranas t-SUV en el sustrato. Pronto se advirtió, sin embargo, que la omisión de un componente clave t-SNARE, SNAP25, desde SBLS preparados de esta manera resultó en v-SUV de atraque y fusión de cinética indistinguisHable de los obtenidos utilizando la completa t-SNARE ^17. Debido SNAP25 es absolutamente necesaria para la fusión in vivo ^30,31, la relevancia fisiológica de estos primeros intentos se puso en tela de juicio. El grupo de Tamm superó este desafío mediante la formación de bicapa controla mejor el apoyo ^21. Se utiliza la deposición de Langmuir-Blodgett por primera valva libre de proteínas de la SBL, seguido de la fusión de esa monocapa con t-SUVs ^21. Esto dio lugar a la fusión SNAP25-dependiente.

Para evitar artefactos potenciales asociados con una bicapa soportada directamente sobre un sustrato de vidrio sin necesidad de utilizar métodos de Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. Introdujo un poli hidratado (etilenglicol) (PEG) amortiguador suave, entre la bicapa y el sustrato ^24. Esta modificación también resultó en la fusión SNAP25 dependiente ^24. Bicapas acolchados en una capa de polímero blando habían sido conocidos para conservar mejor transmembranala movilidad y función de proteínas ^{de 32 años,} y habían sido utilizados en estudios de fusión con virus ^33. Además, bicapas PEGilados parecen conservar cierta capacidad de auto-sanar y son muy robustos ^34,35. En primer lugar, una fracción de cadenas de PEG, de lípidos ligado disponibles comercialmente están incluidos en la membrana de t-SUV. Cuando estas camisetas SUVs se rompen y forman una bicapa planar sobre un sustrato de vidrio, un cepillo de PEG cubre ambas valvas de la bicapa planar. Debido a la formación de bicapa planar es impulsado por la adhesión de las cadenas de PEG que rodean camisetas SUVs sobre la superficie de cristal hidrófilo, estallido liposoma y formación de bicapa planar son relativamente insensibles a la composición lipídica utilizada. Sin embargo, cuando se incluyen grandes cantidades de colesterol, aumentando las propiedades de cohesión de los SUV, las SUVs no pueden estallar de forma espontánea. Si este es el caso, los iones de choque o divalentes osmóticos pueden ser empleados para ayudar a la formación de bicapa planar ^25.

Como se mencionó anteriormente, en este apabordaje un cepillo de PEG cubre ambos lados de la planar, bicapa compatible. El cepillo de cara al canal de flujo de microfluidos ayuda a evitar la adhesión no específica de entrantes v-SUVs que también suelen estar cubiertas de una capa de PEG. La formación de complejos v-t-SNARE y comienza a partir de la membrana distal-N-terminales y procede por etapas hacia los dominios de la membrana ^proximal-36. Para el V-SUV para interactuar con el t-SBL, horizontal y vertical necesidad t-SNARE N-terminales para sobresalir por encima de los cepillos de PEG, que parece ser el caso en las condiciones del ensayo. Altura del cepillo puede adaptarse para estudiar las proteínas distintas de SNAREs variando la densidad de los lípidos PEGilados y la longitud de la cadena PEG ^37,38. Otro de los beneficios de los cepillos de PEG que cubren las superficies proximales de las bicapas de fusión es que se mimetizan con el entorno lleno de las membranas biológicas que están llenas de 30.000-40.000 proteínas integrales de membrana por cuadrado micras ^39. Al igual que las cadenas de PEG en este ensayo, la repucapa de proteína lsive que cubre las membranas biológicas necesita ser empujado a un lado para permitir el contacto entre las dos bicapas de fosfolípidos para la fusión que se produzca.

canales de flujo de microfluidos se utilizan en este ensayo, ya que ofrecen ventajas únicas. En primer lugar, el flujo de microfluidos permite una mayor deposición uniforme de t-SUV a extenderse y se fusionan para formar el t-SBL. En segundo lugar, el volumen del canal pequeña (<1 l), se reduce el consumo de muestra. En tercer lugar, los pequeños volúmenes requeridos permiten todo el experimento que se llevó a cabo bajo un flujo constante. Flujo elimina débilmente, presumiblemente de forma no específica, se adhirieron en V SUVs de la SBL ^16. También mantiene una densidad constante de v-SUV por encima de la t-SBL, lo que simplifica el análisis cinético ^17. Por último, vesículas se acopló se distinguen fácilmente de los libres llevadas por el flujo ^25. En cuarto lugar, varios canales de microfluidos pueden ser utilizados en el mismo cubreobjetos, cada sondeo de una condición diferente. Esto permite la comparación de las condiciones Duriendo la misma corrida experimental. Un enfoque similar ha sido utilizado por el grupo van Oijen para estudiar la fusión entre el virus de la gripe y SBLS acolchados ^33.

En la microscopía TIRF, el decaimiento exponencial del campo evanescente (con una constante de ~ 100 nm) descomposición confines de fluorescencia de excitación a aquellas moléculas que se encuentran en una proximidad muy cercana de la interfaz de la memoria intermedia de cristal. Esto minimiza la contribución de moléculas fluorescentes que están más lejos, aumenta la relación señal-ruido, y permite que la sensibilidad de una sola molécula con tiempos de exposición marco de 10 a 40 mseg. El campo evanescente también conduce a un aumento de la señal en fusión: como la transferencia de lípidos marcados desde el SUV en el SBL, se encuentran, en promedio, en un campo de excitación más fuerte. Este aumento de la fluorescencia es más fuerte para los liposomas más grandes.

Si la luz polarizada se usa para generar el campo evanescente, efectos adicionales contribuyen a los cambios en la fluorescencia tras la tRANSFERENCIA de las etiquetas de los SUV en el SBL. Algunos tintes de lípidos tienen un dipolo de transición orientada con un ángulo medio preferido con respecto a la bicapa en el que están inmersos. Esto crea una diferencia en la cantidad de fluorescencia emitida por los fluoróforos cuando están en la SUV frente a la SBL, ya que el haz polarizado excitará colorantes en las dos membranas de manera diferente. En el primer caso, el haz de excitación va a interactuar con dipolos de transición orientadas alrededor de la camioneta esférica, mientras que para este último, las orientaciones del dipolo se limitarán por la geometría plana SBL. Por ejemplo, cuando se utiliza luz polarizada s incidente (polarizado normal al plano de incidencia), la excitación es más eficiente cuando el colorante se encuentra en el SBL que en el SUV para un orientado paralelo colorante lípidos transición de dipolo a la membrana ^29,40 (como la de Dil o DiD ^41-43). Un SUV dopado con un fluoróforo tal está atenuada cuando se acopla sobre el SBL (Figura 7, representat ive Resultados). Como un poro de fusión se abre y conecta las membranas SUV y SBL, sondas fluorescentes se difunden en la SBL y se vuelven más probabilidades de ser excitada por el campo evanescente polarizada s ^25,27,29. En consecuencia, la señal de fluorescencia integrado alrededor del sitio de fusión aumenta bruscamente durante la transferencia de colorantes de la SUV en el SBL ²⁷ (Figura 3 y Figura 7). Un factor adicional que contribuye a indicar los cambios que acompañan a la fusión se desatenuación de marcadores fluorescentes a medida que se diluyen cuando se transfiere en el SBL. La contribución de desatenuación suele ser menor en comparación con deterioro del campo de polarización y efectos evanescentes en el ensayo descrito aquí, ya que sólo una pequeña fracción ( ) De los lípidos están etiquetados.

El aumento de la señal en fusión puede ser explotado para deducir las propiedades de poro de fusión mediante la comparación del tiempo,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, requerido para un lípido escape a través de un poro que es completamente permeable a los lípidos al tiempo real de la liberación, . Si las dos escalas de tiempo son comparables, sería concluir que el poro presenta poca resistencia al flujo de los lípidos. Sin embargo, si el tiempo de liberación real es significativamente más largo que el tiempo para la liberación de difusión limitada, esto indicaría un proceso, tales como el parpadeo de los poros, que retarda la liberación de los lípidos. El tiempo de liberación de difusión limitada, , Depende del tamaño del liposoma de fusión y lípidos difusividad; su estimación requiere que estos dos parámetros que se deben cuantificar. La sensibilidad única molécula del ensayo permite la difusividad de lípidos que se mide mediante el seguimiento de varios fluoróforos única de lípidos después de su liberación en el SBL para cada evento ^de fusión ^26. El tamaño de cada vesícula fusionandopuede estimarse a ²⁷ mediante la combinación de (i) la intensidad de un solo colorante de los lípidos, (ii) el cambio en la fluorescencia total alrededor de un sitio de acoplamiento después de que todos los fluoróforos se transfieren a la SBL en fusión, (iii) el conocido densidad etiquetado de SUV lípidos, y (iv) la superficie por los lípidos. Para muchos eventos de fusión, se encontró que los tiempos reales de liberación de lípidos a ser mucho más lento de lo esperado por la liberación controlada por difusión ^27, como se ha señalado anteriormente suponiendo tamaño SUV uniforme ^44. Suponiendo retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo, un modelo cuantitativo permite la estimación de la "apertura de poros", la fracción de tiempo que el poro se mantiene abierto durante la fusión ^27.

Siempre que sea posible, es importante para poner a prueba los mecanismos de fusión utilizando tanto los lípidos y las etiquetas de contenidos solubles. Por ejemplo, la liberación de lípidos podría retardarse por procedimientos distintos de parpadeo de poros, tales como la restricción de la difusión de lípidos por las proteínas SNARE que surround camisetasél poro. Si este fuera el caso, entonces la liberación del contenido precedería retira de las etiquetas de lípidos, siempre y cuando el poro es lo suficientemente grande como para permitir el paso de sondas solubles. Un defecto más fundamental en el enfoque podría ser en el supuesto de que la transferencia de lípidos marcados a la SBL se produce a través de un poro de fusión estrecho que conecta el SBL a una vesícula que se ha conservado en gran medida su forma pre-fusión. Transferencia de lípidos en el SBL también podría ser el resultado de una rápida dilatación del poro de fusión con una concomitante, extremadamente rápido colapso de la camioneta en la membrana SBL, como sugerido anteriormente sobre la base de datos de liberación de lípidos solo ^29. Seguimiento tanto de lípidos y contenido liberar de forma simultánea, se encontró que muchos poros volvieron a sellar después de soltar todas sus etiquetas de lípidos, pero conserva algunos de su carga soluble ^27. Esto indica que al menos algunos liposomas no se colapsan en el SBL después de la fusión, y que la transferencia de colorante de los lípidos en el SBL se produce a través de un poro de fusión. Además, lIPID y contenidos de liberación se produjo de forma simultánea ^27, por lo que es poco probable que el retraso de la liberación de lípidos era debido al impedimento de la difusión de lípidos por las proteínas SNARE que rodean el poro ^45.

Un protocolo de fusión SUV-SBL que no Liberar la monitorización de contenidos solubles se publicó anteriormente por Karatekin y Rothman ^25. Aquí, los desarrollos más recientes se incluyen, seguimiento a saber simultánea de lípidos y liberan los contenidos y la estimación de las propiedades de SUV, lípidos, y poro de fusión ^27. El protocolo comienza con instrucciones para la preparación de las células de microfluidos, hechos por la unión de un poli (dimetil siloxano) ranuras (PDMS) de elastómero de bloques que contienen con un cubreobjetos de vidrio ^25. A continuación, se explica la preparación de V-SUVs tanto con lípidos y marcadores de contenido. Las secciones 4 y 5 proporcionan instrucciones para el montaje de las células de microfluidos, formando los SBLS in situ y la comprobación de defectos y la fluidez, la introducción de los Servicios VeterinariosUVS en las células de flujo y la detección de eventos de fusión. Sección 6 proporciona instrucciones para el análisis de datos.

Protocol

1. Preparación de un bloque de PDMS para formar el canal de microfluidos Figura 1. La microfabricación de la plantilla de celda de flujo y la preparación de bloques PDMS. (A) Diseño de una celda de flujo de cuatro canales que se ajusta sobre un cubreobjetos de vidrio 24 x 60 mm (parte inferior). Seis diseños idénticos están dispuestas para que quepan en una oblea de…

Representative Results

Calidad SBL Es crucial para verificar la calidad y fluidez de la SBL antes del experimento de fusión. La fluorescencia en el lado inferior, de vidrio de un canal microfluídico debe ser uniforme, sin defectos evidentes. Si una burbuja de aire pasa a través del canal, se suele dejar cicatrices visibles en el SBL. Si hay tan grandes cicatrices escala / defectos, no use ese canal. A veces los SUV puede adherirs…

Discussion

La implementación exitosa del ensayo de fusión SUV-SBL descrito aquí depende críticamente de varios pasos clave, tales como la reconstitución funcional de las proteínas en liposomas, obteniendo SBLS de buena calidad, y la elección de los parámetros de imagen adecuados para detectar moléculas individuales. Aunque puede tomar algún tiempo y esfuerzo para tener éxito, una vez que el ensayo se lleva a cabo con éxito, proporciona una gran cantidad de información sobre el proceso de fusión no disponible en cualq…

Materials

Reagents
Milli-Q (MQ) water	Millipore
KOH	J.T. Baker	3040-05
Ethanol 190 Proof	Decon
Isopropanol	Fisher Chemical	A416P4
HEPES	AmericanBio	AB00892
Sodium Cholride (KCl)		AB01915
Dithiothreitol		AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	AmericanBio	AB00892
EGTA	Acros Organics	409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4)			25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform	J.T. Baker	9180-01	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol	J.T. Baker	9070-03	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation
Gastight Hamilton syringe	Hamilton	var. sizes	only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)	http://www.hamiltoncompany.com
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16×100 mm screw cap culture tube	Pyrex	70825-16	clean thoroughly, rinse with chloroform	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457	Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening	http://www.avantilipids.com/
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)		840035
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)		850804
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2		840046
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE		810145
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE		880130
cholesterol (ovine wool, >98%)		700000
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)	Molecular Probes	D-307		https://www.thermofisher.com/
Rotavapor R-210	Buchi	R-210	heat bath above Tm of lipids used	http://www.buchi.com/
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside	Affymetrix	0311	store at -20°C, let come to RT before opening	https://www.anatrace.com/
Shaker – Eppendorf Thermomixer R	Eppendorf			https://www.eppendorf.com/
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL	life technologies	66003		https://www.lifetechnologies.com/
Bio-Beads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	1523920		http://www.bio-rad.com/
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556		http://www.sigmaaldrich.com/
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	41121703		https://www.beckmancoulter.com/
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB	Molecular Probes	S-1307		https://www.thermofisher.com/
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm	Bio-Rad	7372512		http://www.bio-rad.com/
Sepharose CL-4B	GE Healthcare	17-0150-01		http://www.gelifesciences.com/
SYPRO Orange Protein Gel Stain	Molecular Probes	S-6650	5,000X Concentrate in DMSO	https://www.lifetechnologies.com/
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS	Dow Corning	3097358-1004		http://www.dowcorning.com/
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover	Corning	3160-152		http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
Hole puncher – Reusable Biopsy Punch, 0.75mm	World Precision Instruments	504529		http://www.wpi-europe.com/
Manual Hole Punching Machine	SYNEO	MHPM-UNV		http://www.syneoco.com/
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch		CR0350265N20R4	drill diameter: 0.9 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD	Cole-Parmer	06419-00	0.010" ID, 0.030" OD	http://www.coleparmer.com/
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD		95802-00	0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass -  cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D	Schott	1472305		http://www.us.schott.com/
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G		http://harrickplasma.com/
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body	Olympus	IX81		http://www.olympus-lifescience.com/en/
EM CCD camera	Andor	ixon-ultra-897		http://www.andor.com/
Thermo Plate, heated microscope stage	Tokai Hit	MATS-U52RA26		http://www.tokaihit.com/
1 ml hamilton glass syringes (4x)	Hamilton	81365		http://www.hamiltoncompany.com
syringe pump	kd Scientific	KDS-230		http://www.kdscientific.com/