Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice
Summary
Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.
Abstract
Timici procede selezione in un microambiente timico unico e altamente organizzata conseguente generazione di un auto-tolerant repertorio cellule T funzionali. Modelli in vitro per lo studio T lineage impegno e sviluppo hanno fornito informazioni preziose questo processo. Tuttavia, questi sistemi hanno la completa ambiente timica tridimensionale necessario per lo sviluppo delle cellule T e, quindi, sono approssimazioni incompleti di selezione timica in vivo. Alcune delle sfide legate allo sviluppo delle cellule T modellazione possono essere superate usando di modelli in situ che forniscono un microambiente del timo intatto che supporta pienamente la selezione timica di sviluppare cellule T. Timo culture fetta organotipica completano esistenti nelle tecniche in situ. fette timo preservare l'integrità delle regioni corticali e midollari del timo e forniscono una piattaforma per studiare lo sviluppo dei timociti sovrapposti di una fase di sviluppo definito o di endogena T cells all'interno di un microambiente del timo maturo. Data la capacità di generare ~ 20 fette al mouse, fette del timo presentano un vantaggio unico in termini di scalabilità per gli esperimenti ad alto rendimento. Inoltre, la relativa facilità nel generare le fette del timo e potenzialmente in grado di sovrapporre diversi sottoinsiemi del timo o altre popolazioni di cellule provenienti da diversi background genetici aumenta la versatilità di questo metodo. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo, l'isolamento e la sovrapposizione dei timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso. Questo sistema può anche essere adattato per studiare lo sviluppo delle cellule T non convenzionale e visualizzarne migrazione timociti, interazioni cellula-timociti stromali, e segnali TCR associati selezione timica mediante microscopia a due fotoni.
Introduction
Cellule T differenziano attraverso una serie di intermedi di sviluppo nel timo durante i quali incontrano diversi controlli che assicurano la generazione di un funzionali, self-tolerant repertorio cellule T 1-3. Selezione positiva favorisce la sopravvivenza dei timociti con i recettori delle cellule T (TCR) in grado di riconoscere, con una bassa a moderata affinità, peptide presentati da grandi molecole complesse di istocompatibilità (MHC) sulle cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) 2,3. Selezione negativa e lo sviluppo delle cellule T regolatorie (T reg) contribuiscono alla creazione di auto-tolleranza attraverso l'eliminazione o la distrazione dei timociti che rispondono con forza di auto-peptide presentato da MHC 2,4. Immaturo CD4 + CD8 + doppio positivo (DP) timociti che esprimono TCR che passano il processo di selezione si differenziano in sottopopolazioni di cellule T mature, la maggior parte dei quali sono di classe I-restricted MHC citotossici CD8 +o MHC di classe II-ristretta singole cellule CD4 + helper positivi (SP) T, prima di uscire il timo per eseguire funzioni effettrici negli organi linfoidi secondari 1-3.
Aggiungendo alla complessità dello sviluppo delle cellule T è la migrazione dinamica e incontri cellulari di sviluppare timociti tutta la rete cellule stromali 5-9. Queste cellule stromali svolgono ruoli distinti nello sviluppo timocita e sono distribuiti in modo differenziale tra le regioni corticali e midollari timo dove positivo e selezione negativa si verificano 10. Anche se la selezione positiva si svolge principalmente nella corteccia, c'è accumulando prove che timociti DP migrano verso il midollo e continuano a richiedere i segnali TCR prima che si differenziano in cellule T mature che suggeriscono che il midollo può fornire segnali aggiuntivi necessari per il completamento della selezione positiva e lignaggio differenziazione 11,12. Ulteriore,nonostante la presenza di cellule specializzate midollari timiche epiteliali (MTEC) che esprimono e presentare gli antigeni tissutali-ristretto che facilitano l'eliminazione dei timociti autoreattivi 13,14, una grande percentuale di selezione negativa si verifica nella corteccia in risposta a espressa ubiquitariamente auto-peptide presentato da dendritiche cellule 15,16. Così, modelli accurati di sviluppo delle cellule T devono fornire un microambiente timico altamente organizzato, con corticale intatta e regioni midollari, che facilita l'interazione tra i timociti e cellule stromali, e supporta la migrazione thymocyte come queste cellule subiscono selezione positiva e negativa.
Per completare ex vivo analisi dei timociti come mezzo per studiare selezione positiva e negativa, un certo numero di in vitro, in situ, e di modelli in vivo di sviluppo delle cellule T sono stati sviluppati 17-22. E 'stato notoriamente difficile ricapitolareselezione positiva in vitro, ma co-coltura di popolazioni di cellule staminali o precursori delle cellule T con cellule stromali che esprimono Notch ligando, in particolare OP9-DL1 / 4 celle, ha la capacità di supportare T lignaggio impegno e la selezione positiva limitata che lo rende un prezioso modello in vitro per studio sullo sviluppo delle cellule T 23-25. Le limitazioni di questo sistema, tuttavia, includono il fatto che queste cellule hanno la macchine di trasformazione peptide unico trovato nelle cellule stromali del timo e il microambiente timico tridimensionale.
Anche se più tecnicamente ingombrante, in situ e di modelli in vivo di selezione timica può superare alcune delle barriere relative a sistemi in vitro. Reaggregate colture d'organo timo (RTOC) contengono miscele di timociti e cellule stromali del timo 18,26,27 definiti. Questi reaggregates cellule epiteliali del timo mantengono MHC di classe I e II espressione e in grado di supportare SVILUPPOnt di entrambi i sottogruppi di cellule T convenzionali, ma mancano ancora definite strutture corticali e midollari. Fetale cultura organo timica (FTOC) è un modello popolare di sviluppo delle cellule T che possono essere testa di serie con timociti attraverso la cultura impiccagione-drop dei lobi timici lymphodepleted o tramite iniezione di timociti in lymphoreplete lobi del timo e sostenere lo sviluppo efficiente di CD4 + e CD8 + cellule nel tempo nella cultura 18,28-31. Al l'inizio della cultura di lobi del timo fetale vi è una scarsità di mTECs, ma strutture corticali e midollari definiti può svilupparsi nel tempo a seconda delle condizioni. Una considerazione importante è che questo modello può preferenzialmente sostenere fetale contro lo sviluppo delle cellule T degli adulti. Infine, l'iniezione intratimica di precursori timici definiti in topi adulti è tecnicamente impegnativo, ma offre chiaramente un ambiente per sostenere Sviluppo delle cellule T in vivo. Questi in situ e di modelli in vivo sono ottimi strumenti to lo sviluppo delle cellule T di studio e il loro utilizzo devono essere considerati a titolo sperimentale-by-esperimento.
Fette timo, tuttavia, hanno recentemente emersi come un modello complementare versatile per studiare selezione timica in situ con la possibilità di ospitare unica, complessa, e gli esperimenti di throughput generalmente superiori. Fette timo mantengono l'integrità delle regioni corticali e midollari e forniscono un quadro di cellule stromali che supporta la migrazione thymocyte durante lo sviluppo, così come la selezione positiva e negativa efficiente 11,32-39. Sottoinsiemi thymocyte aggiunti in cima a fette timo migrano nel tessuto e alla loro appropriata nicchia microambientali 34,37. I timociti sovrapposti possono essere distinte dalle cellule endogene fetta del timo tramite marcatori congenic o etichette fluorescenti e possono essere mantenute in coltura per diversi giorni. culture timica fetta organotipica possono essere utilizzati per studiare i vari aspettidello sviluppo delle cellule T compresa la selezione del timo, il comportamento timociti (migrazione e interazioni cellulari), e la localizzazione thymocyte, tra gli altri. Data la capacità di generare ~ 20 fette del timo per il mouse, la scalabilità degli esperimenti è generalmente maggiore rispetto ad altri modelli in situ di selezione del timo. Sebbene la preparazione di fette timici richiede attrezzature specializzate, quali vibratome, e il tempo di vita di fette timici in coltura è limitata a causa della perdita di cellule nel tempo con morte cellulare e la mancanza di una membrana incapsulante, fette timici forniscono un eccellente modello per l'analisi di selezione del timo delle popolazioni sincronizzate di timociti all'interno di un microambiente timica maturo. Qui si descrive la preparazione di fette timici (compresa la raccolta il timo, l'incorporamento agarosio di lobi timo e vibratome sezionamento del tessuto incorporato), l'isolamento e la sovrapposizione di timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo e risultati rappresentativi di selezione positiva e negativa efficiente di sovrapposizione di preselezione MHC di classe I-limitato TCR timociti transgeniche di citometria a flusso. Questo sistema è stato utilizzato con successo simile per supportare selezione positiva di cellule MHC di classe II-ristrette T CD4 + di preselezione timociti DP 32, e, in presenza di agonisti antigene selezione negativa e thymic T sviluppo reg</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
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