La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata
Summary
Aquí se presenta un protocolo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para estudiar las alteraciones moleculares en Fos-expresión de conjuntos neuronales a partir de tejido cerebral en fresco y congelados. El uso de tejido congelado permite el aislamiento FACS de muchas áreas del cerebro a través de múltiples sesiones para maximizar el uso de sujetos animales valiosos.
Abstract
El estudio de la neuroplasticidad y alteraciones moleculares en los comportamientos aprendidos está cambiando a partir del estudio de las regiones de todo el cerebro para el estudio de un conjunto específico de neuronas activadas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales que median las asociaciones aprendidas. La fluorescencia de células activadas (FACS) ha sido recientemente optimizado para el tejido de cerebro de rata adulta y se permitió el aislamiento de las neuronas activadas usando anticuerpos contra el marcador neuronal NeuN y proteínas Fos, un marcador de neuronas fuertemente activados. Hasta ahora, las neuronas que expresan Fos y otros tipos de células fueron aisladas de tejido fresco, lo que supuso el proceso de días largos y permiten un número muy limitado de muestras de cerebro para ser evaluados después de procedimientos largos y complejos de comportamiento. Aquí encontramos que los rendimientos de las neuronas y ARNm de Fos estriado dorsal Fos-expresión fueron similares entre el tejido y el tejido diseccionado recién congelado a -80 ºC durante 3 – 21 días. Además, se confirmó el fenotipode las células clasificadas NeuN-positivos y NeuN-negativas mediante la evaluación de la expresión de genes de neuronal (NeuN), astrocitos (GFAP), oligodendrocíticos (oligo2) y marcadores microgial (Iba1), lo que indica que el tejido congelado también se puede utilizar para el aislamiento FACS de tipos de células gliales. En general, es posible recoger, analizar y congelar el tejido cerebral para las sesiones múltiples de FACS. Esto maximiza la cantidad de datos obtenidos a partir de sujetos animales valiosos que a menudo han sido sometidos a procedimientos largos y complejos de comportamiento.
Introduction
Durante el aprendizaje, los animales forman asociaciones entre conjuntos complejos de estímulos muy específicos. Esta información de alta resolución se cree que está codificada por alteraciones en los patrones específicos de neuronas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales. Conjuntos neuronales han sido recientemente identificado por la inducción de genes inmediatamente tempranos (IEGs) como Fos, Arco, y Zif268 y sus productos proteicos en las neuronas que se activan durante el fuerte comportamiento o exposición a estímulos. Las neuronas que expresan Fos, en particular, se ha demostrado que desempeñan un papel causal en el contexto y los comportamientos aprendidos 1-4-cue específica. Por lo tanto, neuroadaptaciones moleculares únicas dentro de estas neuronas que expresan Fos-activados son los mejores candidatos para los mecanismos neuronales que codifican las asociaciones formadas durante los trastornos de aprendizaje y aprendizaje normales, anormales, como la adicción y trastorno de estrés postraumático (TEPT) 5 aprendidas.
FluoreScence de células activadas (FACS) ha permitido recientemente análisis de neuroadaptaciones moleculares únicas dentro de las neuronas que expresan Fos. La citometría de flujo y clasificación de células se desarrollaron en la década de 1960 6,7 para caracterizar y aislar células de acuerdo con sus características de dispersión de luz y de inmunofluorescencia, y han sido utilizados en la inmunología y la investigación del cáncer. Sin embargo citometría de flujo y FACS requiere células individuales disociados que son difíciles de obtener a partir de tejido de cerebro adulto. FACS se utilizó primero para aislar y analizar la proteína verde fluorescente (GFP) que expresan las neuronas del cuerpo estriado de los ratones transgénicos que no requiere etiquetado anticuerpo 8,9. Hemos desarrollado un método FACS basada en anticuerpos 10 para aislar y evaluar alteraciones moleculares en las neuronas activadas por drogas y / o señales en los animales de tipo salvaje 11-15 Fos-expresión. En este método, las neuronas se marcaron con un anticuerpo contra el marcador neuronal NeuN en general, mientras que las neuronas activado fuertementeson etiquetados con un anticuerpo contra Fos. A pesar de que nuestro método inicial necesaria puesta en común de hasta 10 ratas por muestra de tejido fresco, modificaciones posteriores del protocolo permitió el aislamiento FACS de Fos-expresión de las neuronas y de la polimerasa cuantitativa Reacción en Cadena de análisis (qPCR) de áreas discretas del cerebro a partir de una sola rata 13-15 . En general, no se encontraron alteraciones moleculares únicas en las neuronas activadas durante una variedad de comportamientos y al contexto de referencia en la investigación activados por la adicción 12,14,15 Fos-expresión.
Un importante problema logístico con la realización de FACS en tejido fresco es que se necesita un día entero para disociar el tejido y el proceso por FACS. Además, sólo cuatro muestras pueden ser procesadas por día. Esto generalmente significa que sólo un área del cerebro puede ser evaluado de cada cerebro y las restantes áreas del cerebro tienen que ser desechados. Este es un problema importante para los procedimientos de comportamiento bajo rendimiento, tales como la auto-administración y trai extinciónNing que requiere cirugía y de muchas semanas de entrenamiento intensivo. Además, los procedimientos largos y complicados de comportamiento en el día de la prueba hace que sea difícil llevar a cabo FACS en el mismo día. Sería una ventaja significativa para poder congelar los cerebros de los animales inmediatamente después de las pruebas de comportamiento, y luego aislar las neuronas que expresan Fos-de una o más áreas del cerebro en diferentes momentos de la elección de los investigadores.
Aquí demostramos que nuestro protocolo de FACS se puede utilizar para aislar las neuronas que expresan Fos-(y otros tipos de células) de tejido cerebral fresco y congelado. Como ejemplo, se aislaron neuronas de cuerpo estriado de rata después de las inyecciones de metanfetamina agudos y de ratas ingenuas sin inyecciones (condición control) Fos-expresión. Sin embargo, este protocolo FACS se puede utilizar después de cualquier tratamiento conductual o farmacológico. análisis de qPCR posterior de las muestras indicó que la expresión de genes a partir de estos tipos de células puede ser evaluada con similar la eficiencia a partir de tejido en fresco y congelados.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS se pueden utilizar para clasificar las neuronas y otros tipos de células de cualquiera de los tejidos del cerebro adulto fresca o congelada. Como se mencionó en la introducción, la capacidad de utilizar tejido congelado permite la utilización óptima de muestras de animales que han sido sometidos a procedimientos conductuales complejas y prolongadas, tales como estudios de autoadministración y la recaída en la adicción a la investigación. Estos procedimientos conductuales suele tardar 1 – 2 horas o más, y …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
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