Summary

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Published: November 11, 2016
doi:

Summary

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Abstract

Le transfert adoptif de lymphocytes ex vivo élargi infiltrant les tumeurs autologues (TIL) peut servir de médiateur des réponses durables et complets dans des sous – ensembles importants de patients atteints de mélanome métastatique. Les principaux obstacles de cette approche sont la viabilité réduite des cellules T transférées, causées par le raccourcissement des télomères, et le nombre limité de TIL obtenus à partir de patients. des cellules T différenciées avec moins longs télomères serait un sous-ensemble de cellules T idéal pour une thérapie adoptive des lymphocytes T, mais, en générant un grand nombre de ces cellules T différenciées moins est problématique. Cette limitation de la thérapie adoptive de cellules T peut être théoriquement surmonté en utilisant des cellules souches pluripotentes induites (CISP) que l'auto-renouvellement, maintenir télomères pluripotence, ont allongées, et de fournir une source illimitée de cellules T autologues pour l'immunothérapie. Ici, nous présentons un protocole pour générer CSPi en utilisant des vecteurs de virus Sendai pour la transduction des facteurs de reprogrammation en TIL. Ce protocole génèrents entièrement reprogrammées, clones sans vecteur. Ces CSPi TIL dérivés pourraient être en mesure de générer des cellules T patient et spécifiques de tumeurs moins différenciées pour la thérapie adoptive de cellules T.

Introduction

La technologie de reprogrammation cellulaire qui permet la génération de cellules souches pluripotentes induites (CISP) via la surexpression d'un ensemble défini de facteurs de transcription est très prometteuse dans le domaine des thérapies cellulaires 1,2. Ces CSPi présentent des caractéristiques de transcription et épigénétiques et ont la capacité d'auto-renouvellement et la pluripotence, de manière similaire à des cellules souches embryonnaires (CSE) 3-5. Des progrès remarquables réalisés dans la technologie de reprogrammation au cours de la dernière décennie nous a permis de générer des CSPi humaines , même à partir de cellules différenciées, telles que les cellules T 6-8. T iPSCs dérivées de cellules (TiPSCs) conservent la même configuration réarrangé de récepteur des cellules T (TCR) des gènes de chaîne comme les cellules T d' origine, ce qui permet la régénération des cellules T spécifiques d'antigène à partir TiPSCs 11/09.

Près de 80% des lymphocytes infiltrant de mélanome (TILs) obtenu à partir de la tumeur d'un patient à reconnaître spécifiquement des antigènes associés à une tumeur d'unnd maintenir cytotoxicité contre les cellules cancéreuses d' origine 12. En particulier, l'expression de la mort cellulaire programmée protein-1 (PD-1) sur des TIL a été trouvée pour identifier le répertoire de tumeur autologue réactif, notamment muté lymphocytes CD8 + 13 spécifiques à néoantigène. Le transfert adoptif de l' ex-vivo de TIL autologues expansées en combinaison avec les schémas de préparation et lymphodepleting administration systémique de l' Interleukine-2 (IL-2) peut provoquer une régression substantielle du mélanome métastatique dans les sous – ensembles de patients 14. Malgré des résultats encourageants dans des modèles précliniques et chez les patients, une mauvaise survie des cellules T infusées et l'existence de voies immunosuppresseurs semblent compromettre le plein potentiel de la thérapie adoptive de cellules T. Les protocoles cliniques actuels exigent beaucoup de manipulation ex vivo de cellules T autologues afin d'obtenir un grand nombre. Cela se traduit par la génération de cellules différenciées T qui ont une faible survie, prol réduitela capacité iferative et des niveaux élevés de PD-1 15.

Cette limitation de la thérapie adoptive de cellules T peut être théoriquement surmonté en utilisant CSPi qui peuvent fournir une source illimitée de cellules T autologues pour l'immunothérapie. Nous avons récemment rapporté la reprogrammation du mélanome TIL exprimant des taux élevés de PD-1 par le virus Sendai (SeV) de transduction médiée des quatre facteurs de transcription, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-myc 16. Bien que des vecteurs rétroviraux nécessitent l'intégration dans les chromosomes de l'hôte pour exprimer des gènes de reprogrammation, vecteurs SeV sont non-intégration et sont finalement éliminés du cytoplasme. Reprogrammant l' efficacité est beaucoup plus élevé avec un système de SeV par rapport aux vecteurs de lentivirus ou retrovirus 6-8. En outre, en particulier SeV peut reprogrammer les cellules T dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP), tandis que certains clones générés par iPSC lentivirus ou des vecteurs rétroviraux peuvent provenir de lignées non lymphoïdes 6-8. Ici, nous détaillonsles procédures mises en œuvre pour l'isolement et l'activation du mélanome humain TIL et pour la génération de CSPi TIL dérivées en utilisant un système de reprogrammation SeV.

Protocol

NOTE: Les patients doivent donner un consentement éclairé à participer à la commission d'examen institutionnel et souches pluripotentes humaines Comité cellulaire approuvé l'étude. 1. Isolement et culture de TIL Obtenir matériel tumoral qui ne sont pas requis pour le diagnostic histopathologique du noyau d'approvisionnement service de pathologie / tissu. Placer 20-100 g d'échantillons de tumeur dans un tube de 50 ml avec 30 ml de milieu de tumeur collecte …

Representative Results

La figure 1 représente la vue d' ensemble de la procédure qui implique l'expansion initiale du mélanome TIL avec rhIL-2, qui est suivie par une activation avec un anti-CD3 / CD28 et le transfert de gène de OCT3 / 4, KLF4, SOX2, et c-Myc pour TIL pour la production d'iPSCs. Habituellement, TIL sur la culture avec rhIL-2 commencent à se former des sphères 21-28 jours après le début de la culture. À ce stade, TIL sont prêts à être activés avec anti-…

Discussion

Ici, nous avons démontré un protocole pour la reprogrammation TIL de mélanome à CSPi par transduction SeV-médiation des quatre facteurs de transcription OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-MYC. Cette approche, en utilisant un système de SeV pour reprogrammer les cellules T, offre l'avantage d'une méthode non intégrant 7.

Une étude antérieure a montré qu'un système de reprogrammation du SeV a été très efficace et fiable pour reprogrammer non seulement les fibroblas…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

Materials

gentle MACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentle MACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929
RPMI 1640 Life technologies 11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer BD 352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes BD 352070
IMDM Life technologies 12440053
human AB serum Life technologies 34005100
L-glutamine (200mM) Life technologies 25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) Life technologies 21985-023
Penicillin-Streptomycin  Life technologies 15140-122
gentamicin Life technologies 15750-060
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-02
D-PBS (-) Life technologies 14040-133
recombinant human (rh) IL-2 Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 BD 555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 BD 555725
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
FBS Gibco 26140-079
HEPES Life technologies 15630-080
N-Acetylcysteine Cumberland Pharmaceuticals Inc. NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well) Corning 353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well) Corning 353047
Sendai virus vector DNAVEC
SNL feeder cells Cell Biolabs, Inc CBA-316
mitomycin C SIGMA M4287 soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin SIGMA G1890
Primate ES Cell Medium Reprocell RCHEMD001 warm in 37 ℃ water bath before use
basic fibroblast growth factor (bFGF) Life technologies PHG0264
ReproStem Reprocell RCHEMD005 warm in 37 ℃ water bath before use

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Saito, H., Iwabuchi, K., Fusaki, N., Ito, F. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54375, doi:10.3791/54375 (2016).

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