Summary
هنا، يتم وصف أسلوب باستخدام غشاء النظام العدوى قابلة للاختراق القائم على إدراج لدراسة آثار ستربتوليزين S، السم يفرز التي تنتجها المجموعة العقدية، على القرنية. هذا النظام يمكن تطبيقه بسهولة لدراسة البروتينات البكتيرية يفرز الأخرى على مختلف أنواع الخلايا المضيفة خلال العدوى.
Abstract
العديد من مسببات الأمراض البكتيرية تفرز السموم قوية للمساعدة في تدمير الأنسجة المضيف، لبدء التغييرات يشير في الخلايا المضيفة أو التلاعب استجابات جهاز المناعة خلال العدوى. على الرغم من أساليب وضعت لتنقية بنجاح وإنتاج العديد من هذه العوامل الفوعة مهمة، لا تزال هناك العديد من السموم البكتيرية التي بنية فريدة من نوعها أو تعديلات واسعة النطاق بعد متعدية جعل من الصعب تنقية ودراسة في نظم في المختبر. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يمكن الحصول على السم النقي، وهناك العديد من التحديات المرتبطة بدراسة آثار محددة من السم في ظل الظروف الفسيولوجية ذات الصلة. الأكثر في نماذج زراعة الخلايا في المختبر يهدف إلى تقييم آثار السموم البكتيرية يفرز في الخلايا المضيفة تنطوي على احتضان الخلايا المضيفة مع جرعة لمرة واحدة من السم. هذه الأساليب سيئة تقارب ما الخلايا المضيفة في الواقع تجربة أثناء وجود عدوى، حيث يتم إنتاج السم باستمرار من قبلالخلايا البكتيرية والسماح لتتراكم تدريجيا خلال العدوى. يصف هذا البروتوكول تصميم نظام عدوى بكتيرية أساس إدراج-نفاذية الغشاء لدراسة آثار ستربتوليزين S، مادة سامة قوية تنتجها المجموعة العقدية، على القرنية الطلائية الإنسان. هذا النظام تحاكي بشكل وثيق البيئة الفسيولوجية الطبيعية خلال العدوى من الطرق حيث السم النقي أو supernatants البكتيرية يتم تطبيقها مباشرة إلى الخلايا المضيفة. الأهم من ذلك، كما يلغي هذا الأسلوب التحيز الردود المضيف الذي من المقرر أن الاتصال المباشر بين البكتيريا والخلايا المضيفة. وقد استخدم هذا النظام لتقييم فعالية آثار ستربتوليزين S (SLS) على المضيف سلامة الغشاء، والسلامة الخلوية، والاستجابات يشير الخلوية. هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة لدراسة عوامل الفوعة أخرى يفرزها على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المضيفة الثدييات للتحقيق في دور معين من البكتيريا تفرز عامل دأورينغ مسار العدوى.
Introduction
فهم وظيفة عوامل الفوعة البكتيرية في سياق عدوى الخلية المضيفة هو التركيز الرئيسي للأبحاث المرضية البكتيرية. العديد من مسببات الأمراض البكتيرية تفرز بنشاط السموم والعوامل القابلة للذوبان أخرى للمساعدة في تدمير الأنسجة المضيف، لبدء التغييرات يشير في الخلايا المضيفة أو التلاعب استجابات جهاز المناعة خلال العدوى 1-10. على الرغم من أساليب وضعت لتنقية بنجاح وإنتاج العديد من هذه العوامل الفوعة الهامة للدراسة، وبعض المنتجات البكتيرية لديها هياكل فريدة من نوعها أو تعديلات واسعة النطاق بعد متعدية التي تجعلهم مرشحين المتمردة لطرق تنقية، وبالتالي لا يمكن دراستها بمعزل استخدام في أنظمة المختبر . على سبيل المثال، المجموعة الأولى العقدية، والبكتيريا الممرضة مسؤولة عن عدد لا يحصى من الأمراض بدءا من البلعوم إلى التهاب اللفافة الناخر ومتلازمة الصدمة السامة، وتنتج يفرزالسم البكتيري المعروف باسم ستربتوليزين S (SLS) 11-17. يتم ترميز هذا الببتيد أنتجت ribosomally من قبل الكتلة الجين ستربتوليزين S المرتبطة بها (تبلد)، وتشير التقديرات إلى أن المنتج ناضجة لتكون 2.7 كيلو دالتون في حجم 14-17. وبديئة الذيفان، المشفرة بواسطة الملحمة، يتم تعديل بعد translationally من قبل العديد من الأنزيمات (SagB، SagC، وSAGD) لإنتاج شكل ناضج، وظيفية 15-17. وتعقد هذه التعديلات بعد متعدية إلى جانب تسلسل الأحماض الأمينية غير عادية السم لجعلت السم يتنافى مع كل الجهود توضيح تنقية والهيكل الذي تم الشروع حتى الآن 15،17. هذه التحديات لها تعقيد الجهود الرامية إلى تحديد دور محدد من هذه المادة السامة في التسبب المضيف.
في الحالات التي يكون فيها إعداد السموم تنقيته أو عوامل أخرى يفرز إما معقدة أو غير ممكن، وآليات لتوضيح تقليديا درس وظيفة من هذه المنتجات من خلال إعداد supernatants البكتيرية التي تمت تصفيتها، والتي يتم تطبيقها على الخلايا المضيفة 18-20. وهناك العديد من التحديات المرتبطة مع هذه التقنية. أولا، وكثير من هذه العوامل يفرز، بما في ذلك SLS، لا في المحافظة على النشاط الأقصى أو ثابت عند تخزينها وتطبيقها على الخلايا المضيفة في وقت لاحق. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم جمع supernatants عند نقطة زمنية واحدة ومن ثم تطبيقها على الخلايا المضيفة، فإنه من الصعب تحديد مدى الفسيولوجية والتوصل إلى استنتاجات مباشرة عن عملية العدوى الطبيعية، حيث يسمح للعوامل يفرز تتراكم خلال العدوى ل تركيز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ينطبق هذا التحدي الثاني ليس فقط لاستخدام supernatants البكتيرية، ولكن أيضا لاستخدام السموم تنقيته في دراسات الخلية المضيفة 1 - 3،8. لمعالجة هذه القضايا، وINSE نفاذية الغشاءوقد تم تطوير نظام العدوى مقرها غ لتقييم آثار SLS على الخلايا المضيفة بطريقة تحافظ على النشاط السم الأمثل وأيضا يزيل متغير من الاتصال المباشر بين البكتيريا والخلايا المضيفة. في هذا النظام، وتزرع الخلايا الظهارية الإنسان في أحادي الطبقة في الغرفة السفلى من مجلسين جيدا، وأدخلت البكتيريا في الغرفة العليا من نفس البئر. غشاء مسامي (0.4 ميكرومتر المسام) يفصل بين الغرف العلوية والسفلية، مما يسمح للعوامل يفرز التي يتم تبادلها بين الغرفتين ولكن منع مرور البكتيريا. وقد سمح هذا النظام لتقييم فعالية الاستجابات المضيفة التي ترجع إلى مكونات بكتيرية يفرز حقت فقط حين القضاء على الردود التي قد تحدث من خلال الاتصال المباشر أثناء عدوى المجموعة. على الرغم من العوامل البكتيرية يفرز أخرى إلى جانب SLS يمكن أن تمر أيضا من خلال غشاء مسامي، واستخدام لوحة متحولة إسوي بما في ذلك النوع البري (WT)، وSLS-KNockout (ΔsagA) ويكمل سلالة الملحمة (ΔsagA + الملحمة) يسمح لتقييم دقيق للردود المضيفة التي هي بدقة 21 تعتمد SLS.
على الرغم من أن أنظمة إدراج غشاء نفاذية مماثلة قد استخدمت لدراسة العوامل يفرز المشاركة في الالتهابات الفيروسية، بيولوجيا السرطان، وجهاز المناعة الهجرة الخلية 22 - 26، عدد قليل من الدراسات التي تنطوي على التفاعلات البكتيرية مع الخلايا المضيفة وقد استخدمت هذه الطريقة 6،27،28. حتى الدراسات التي تستخدم هذه النظم لاستكشاف التفاعلات بين البكتيريا والخلايا المضيفة وركزت في المقام الأول على هجرة الخلايا الالتهابية أو البكتيريا من خلال أحادي الطبقة الظهارية أو البطانية مطلي على إدراج نفاذية الغشاء. النظام العدوى أساس إدراج غشاء نفاذية الموصوفة هنا هي طريقة بسيطة وفعالة تعتمد على الفصل بين البكتيريا والخلايا المضيفة عبر غشاء مسامي لتقييم EFFEسنت من السم يفرز، SLS، على سلامة غشاء المضيف، والسلامة الخلوية المتنقلة نقل الإشارة، والعوامل الخلية المضيفة يفرز. هذه التقنية يمكن تكييفها وفقا لدراسة عوامل الفوعة أخرى يفرزها على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المضيفة الثدييات للتحقيق في دور عامل جرثومي محدد على مدى وجود عدوى.
Protocol
1. البكتيرية الثقافة
- توليد سلالات متحولة إسوي لاستخدامها في دراسة العوامل يفرز محددة من الفائدة 21.
ملاحظة: GASM1T1 5448 سلالات تستخدم لهذه التجارب شملت WT غاز "، قطة الملحمة Δ SLS التي تعاني من نقص متحولة (مختصر في النص كما Δ الملحمة)، وتستكمل سلالة الملحمة (اختصار في النص كما Δ الملحمة + الملحمة) 21. - إعداد الثقافات السائل بين عشية وضحاها من السلالات البكتيرية من الفائدة. تنمو غاز M1T1 5448 سلالات في -10 مل من تود هيويت مرق عند 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة قبل اصابة الخلايا البشرية.
- الطرد المركزي الثقافات بين عشية وضحاها البكتيرية (2400 إطار التعاون الإقليمي لمدة 10 دقيقة) و resuspend في المتوسط بكتيريا جديدة.
ملاحظة: إعادة تعليق في نفس الحجم كما كانت تزرع الثقافات بين عشية وضحاها في (5-10 مل) تنتج عادة الكثافة البصرية الأولية مرغوب فيه. - تطبيع الثقافات البكتيرية ليتم الحصول على تركيزات انطلاق متساوية تمييع إعادة علقت الثقافات في المتوسط البكتيري إضافية حتى نفس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) لجميع سلالات لفحصها (OD 600 من حوالي 1.0 يستحب للراحة).
ملاحظة: في هذه الدراسات، استخدمت مرحلة ثابتة الثقافات البكتيرية لتصيب الخلايا المضيفة مباشرة بعد التطبيع. ومع ذلك، حيث أن بعض سلالات من البكتيريا مرحلة ثابتة خروج nonsynchronously أنه قد يكون من الأنسب أن تبدأ العدوى المضيف مع الثقافات مرحلة السجل إذا كان هذا وجدت أن هذا هو الحال بالنسبة للسلالات من الفائدة. - قبل إجراء مزيد من التحليل، نفذ مستعمرة عد فحص لتحديد مستعمرة (كفو) في الملليمتر الواحد موجودة في الثقافات ابتداء من ذلك أن تعدد العدوى (وزارة الداخلية)، أو نسبة البكتيريا في الخلية المضيفة، يمكن تحديدها.
- إعداد 1 مل التخفيفات المسلسل من الثقافات البكتيرية التي تم تطبيع إلى densi البصرية المرجوةتاي في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو متوسطة نمو البكتيريا المناسب (تم استخدام تود هيويت مرق في هذه الدراسات). إعداد التخفيفات تتراوح بين 10 -1 إلى 10 -6 لإنتاج مجموعة واحدة على الأقل من لوحات أجار مع المستعمرات المعدودة (30-300 المستعمرات). أداء جميع التخفيفات في ثلاث نسخ.
- نقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي على لوحة آغار تحتوي على المتوسط المناسب لأنواع البكتيريا التي يجري تحليلها.
ملاحظة: تم استخدام تود هيويت أجار في هذه الدراسات. - استخدام الزجاج أو رش البكتيرية من البلاستيك لتوزيعها بالتساوي على قسامة 100 ميكرولتر عبر كامل سطح لوحة أجار، ومواصلة نشر حتى يتم امتصاص السائل في آغار. أداء تحت اللهب باستخدام تقنية معقمة.
- احتضان لوحات أجار عند 37 درجة مئوية خلال الليل أو حتى تظهر المستعمرات المعدودة.
- عدد المستعمرات التي تنمو على كل لوحة وحساب كفو / مل في الثقافة الأصلية التي formu التاليةلا: عدد المستعمرات س معكوس حجم تخفيف / ثقافة التسلسلي مطلي في ملليلتر.
على سبيل المثال (200 المستعمرات س 1/10 -5 تمييع) / 0.1 مل مطلي = 2.0 × 10 8 كفو / مل
زراعة الخلايا 2. المضيف
- الحصول على خط الخلية المضيفة المناسب للتحاليل المطلوبة.
ملاحظة: HaCaT القرنية الطلائية الإنسان 29، وهدية عينية من V. Nizet استخدمت لهذه الدراسات.- الحفاظ على خلايا HaCaT في أطباق ثقافة 100 ملم في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS). احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
العدوى خلية 3. المضيف مع نافذ غشاء إدراج نظام
- لوحة الخلايا في أطباق مناسبة زراعة الأنسجة وتسمح لها أن تنمو حتى تصل إلى 90٪ confluency.
ملاحظة: الخلايا HaCaT المستخدمة في هذه الدراسات عادة تصل confluency ضمن 2-3 دآيس بعد الطلاء.- لجمع المحللة (على سبيل المثال يشير تحليل وأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) المقايسات تقرير)، لوحة خلايا HaCaT في 6 أطباق بشكل جيد في مناطق ذات كثافة البذر من حوالي 3 × 10 5 خلايا / جيد.
- لتجارب التصوير المناعي، وخلايا لوحة coverslips على الزجاج معقمة في غضون 6 أطباق جيدا في مناطق ذات كثافة البذر من حوالي 3 × 10 5 خلايا / جيد.
- لإيثيديوم permeabilization غشاء homodimer ونازعة اللاكتات (LDH) فحوصات الإفراج عنهم، لوحة خلايا HaCaT في 24 الأطباق جيدا في مناطق ذات كثافة البذر من حوالي 5 × 10 4 خلايا / جيد.
- مباشرة قبل العلاج، وغسل الخلايا مع 1X برنامج تلفزيوني العقيمة.
- تطبيق متوسط نمو جديدة للخلايا. لظروف وصفها هنا، تطبيق 2 مل المتوسطة لكل بئر لمدة 6 لوحات جيدا أو 0.5 مل المتوسطة لكل بئر لمدة 24 لوحات جيدة. إذا كان يتم اختبار العلاجات الدوائية، مع مزيج من متوسطة جديدة وتطبيق خلال هذا الظريفص.
ملاحظة: قد تتطلب بعض المقايسات وسائل الإعلام البديلة. على سبيل المثال، والفينول تتداخل تركيزات الأحمر وارتفاع مصل مع مقايسة الافراج LDH، الفينول الحمراء الخالية DMEM تستكمل مع 1٪ زلال المصل البقري (BSA) (ث / ت)، 2 مم L-الجلوتامين، وكان 1 ملم البيروفات الصوديوم تستخدم لهذه التجارب. - بعد أن تم تطبيقها متوسطة جديدة، وضع بعناية العقيمة 0.4 ميكرون نفاذية غشاء إدراج في كل بئر. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء تدفق الصفحي، واستخدام ملقط معقم لنقل إدراج نفاذية الغشاء في كل بئر.
- تطبيق جديد مستنبت الخلية إلى الغرفة العليا من كل بئر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لظروف وصفها هنا، تطبيق 1 مل المتوسطة لكل بئر لمدة 6 لوحات جيدا أو 0.1 مل المتوسطة لكل بئر لمدة 24 لوحات جيدة.
- تطبيق حجم مناسب من الثقافات البكتيرية تطبيع (انظر القسم 1) إلى الغرفة العليا من نظام إدراج نفاذية الغشاء. استخدام المتوسط البكتيري للمقاولات غير مصابالعلاجات رأ. للحصول على نتائج وصفها هنا، إضافة 25 ميكرولتر من الثقافات تطبيع في غرفة لمدة 24 لوحات جيدة وإضافة 100 ميكرولتر من الثقافات في غرفة لمدة 6 لوحات جيدا.
ملاحظة: في هذه الدراسات، تم تطبيق النوع البري أو غاز متحولة إلى الخلايا المضيفة في احتسب زارة الداخلية من 10. وزارة الداخلية بناء على أعداد الخلايا حقيقية النواة النهائية (مثل 2 × 10 6 خلايا / جيد)، مثل أن 10 أضعاف البكتيريا أضيفت في الخلية المضيفة في بداية فترة العدوى (مثل 2 × 10 7 كفو لكل بئر). سوف تختلف المناسبة زارة الداخلية مع الأنواع البكتيرية المختلفة ومع التحليلات المتابعة المطلوبة.
ملاحظة: بالإضافة إلى استخدام المتوسط البكتيري لعناصر غير المصابة، وضوابط أخرى مفيدة لتطبيقات معينة من هذه التقنية يمكن أن تشمل البكتيريا قتل حرارة أو قضى المتوسط البكتيري للمقارنة. - احتضان الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
مجموعة 4. عينة
<رأ>- جمع المتوسطة من مجلس النواب إلى 1.5 مل أنابيب. تجنب إزعاج أحادي الطبقة خلال جمع.
- عينات الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 14000 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي.
- إزالة كافة ولكن 50 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 مل الطازجة ومخزن في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
- نضح بلطف المتوسطة فوق أحادي الطبقة من الخلايا المضيفة. تجنب إزعاج أحادي الطبقة، لأن هذا قد يؤدي إلى فقدان العينة.
- شطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
- نضح بلطف برنامج تلفزيوني. تطبيق على الفور حجم مناسب من تحلل العازلة الجليد الباردة لتحقيق تركيز البروتين المطلوب، واحتضانعينات على الجليد لمدة 15 دقيقة. تطبيق بين 200 ميكرولتر و 350 ميكرولتر من تحلل العازلة لكل بئر من كل لوحة 6 جيدا لتحقيق تركيزات البروتين بين 0.5 و 1.5 ملغ / مل.
ملاحظة: تحلل العازلة المستخدمة في هذه الدراسات كان يتألف من الماء منزوع الأيونات، 1٪ (ت / ت) البديل Nonidet P40، كوكتيل الفوسفاتيز المانع، والكوكتيل مثبط البروتياز. وترد الكواشف محددة في قسم المواد والمعدات. - استخدام مكشطة خلية لفصل الخلايا من سطح لوحة من كل بئر وماصة محتويات كل بئر في أنبوب 1.5 مل.
- عينات الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 14000 لمدة 20 دقيقة على 4 ج.
- لتقييم مكونات المحللة القابلة للذوبان، وإزالة طاف لأنبوب جديد ومخزن في -20 C أو استخدامها على الفور.
- لتقييم مكونات غير قابلة للذوبان المحللة النووية أو غيرها، حجز بيليه ومخزن في -20 C أو استخدامها على الفور.
- مثلالقراصنة المتوسطة وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X البارد.
- إصلاح الخلايا بين عشية وضحاها في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) حل في برنامج تلفزيوني (ث / ت).
ملاحظة: في هذه الدراسات، تم إضافة 1 مل من PFA لكل بئر من كل لوحة 6 جيدا.
5. واقترح تقديم الطلبات
- استضافة تحليل الإشارات تنبيغ بواسطة SDS-الصفحة والتنشيف الغربية
- جمع لست] الخلية المضيفة كما هو موضح في القسم 4.3.
- تحديد تركيز البروتين من كل المحللة عينة من حمض bicinchoninic (BCA) فحص أو ما يعادلها باستخدام معايير بروتين 30.
- تطبيع تركيزات البروتين بين العينات قبل تحميل وتشغيل عينات على هلام بولي أكريلاميد 4-15٪ أو مناسبة بديلة 31.
- تطبيع تركيزات عينة من قبل pipetting نفس كمية البروتين من كل عينة (على سبيل المثال 20 ميكروغرام) في أنبوب جديد مل 1.5 وإضافة كميات متفاوتة من تحلل العازلة (حجم المخزن = السعة الإجمالية - حجم العينةالمضافة) إلى كل أنبوب لجعل الحجم الكلي (على سبيل المثال 50 ميكرولتر) والأخير يعادل تركيز البروتين في عينات.
- بنقل العينات إلى فلوريد البولي فينيل (PVDF) غشاء (أو ما يعادلها). للحصول على نتائج وصفها هنا، ونقل العينات عند 25 فولت لمدة 2 ساعة قبل زيادة الجهد 70 فولت لمدة 45 دقيقة إضافية. استخدام عازلة نقل تتألف من 200 ملي تريس قاعدة، 1.5 M الجلايسين و 20٪ الميثانول (ت / ت) في الماء منزوع الأيونات.
- الأغشية كتلة في 5٪ BSA + 0.1٪ توين 20 في تريس مخزنة المالحة (TBS). ضبط وفقا لذلك بناء على توصيات الشركة المصنعة لأجسام مضادة لاستخدامها.
- احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. استخدام في تصنيع أوصى التخفيف.
- غسل الأغشية لمدة 1.5 ساعة في TBS + 0.1٪ توين 20؛ تحديث العازلة كل 10-15 دقيقة.
- احتضان مع الفجل البيروكسيد (HRP) -conjugated الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1: 5000 لمدة 1.5 ساعة في غرفة temperatلدى عودتهم.
- غسل الأغشية لمدة 1.5 ساعة في TBS + 0.1٪ توين 20؛ تحديث العازلة كل 10-15 دقيقة.
- احتضان الأغشية مع كاشف كشف التوهج قبل وضع على الفيلم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ويمكن استخدام طرق الكشف الأخرى كما تريد.
- المضيف خلية المناعي تلطيخ والتصوير
- إصلاح coverslips التي تحتوي على الخلايا المضيفة كما هو موضح في القسم 4.4.
- إزالة الحل PFA وتغسل coverslips التي تحتوي على الخلايا المعالجة مرتين في برنامج تلفزيوني، الشفط بين يغسل.
ملاحظة: PFA شديدة السمية ويجب التخلص منها بشكل مناسب. - منع لل coverslips لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني مع 1٪ (ث / ت) مصل الماعز العادي، 2٪ (ت / ت) تريتون X-100، و 0.5٪ (ت / ت) توين 20.
- غسل coverslips مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة، ومنعش المخزن المؤقت كل 10 دقيقة.
- لاحتضان coverslips مع الأجسام المضادة الأولية بنسبة 01:50 (أو على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) في عرقلة سولution بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل لل coverslips لمدة 1.5 ساعة في برنامج تلفزيوني، ومنعش للالعازلة كل 30 دقيقة.
- لاحتضان coverslips لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الضد الثانوية (كانت تستخدم الماعز المضادة للأرنب مفتش AlexaFluor488 لهذه الدراسات) باستخدام نسبة 1: 200 من الأجسام المضادة لعرقلة الحل.
- غسل coverslips لمدة 1 ساعة، ومنعش المخزن المؤقت كل 20 دقيقة.
- تطبيق البقع المرجوة.
ملاحظة: هذه الدراسات تستخدم دابي (وصمة عار النووية) ورودامين-phalloidin (الأكتين وصمة عار) على نسب من 1: 1000 في عرقلة الحل. - احتضان coverslips مع البقع النووية والأكتين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل coverslips في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومنعش للالعازلة كل 10 دقيقة.
- جبل لل coverslips على الشرائح الزجاجية باستخدام المتوسطة المتزايدة.
- السماح coverslips لضبط على الشرائح بين عشية وضحاها قبل الختم والتصوير. للحصول على نتائج وصفها هنا، جمع الصور على باليود مضان المجهرنانوغرام هدف 20X القياسية. استخدام يماغيج والتصوير المجهر برنامج لمعالجة الصور الملتقطة.
- إيثيديوم Homodimer الفحص موت الخلية
- نضح المتوسطة من كل بئر وغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
- تطبيق 4 ميكرومتر إيثيديوم homodimer-1 في برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- تحديد مستوى مضان باستخدام قارئ لوحة المقرر أن 528 الإثارة نانومتر و 617 نانومتر انبعاث بقيمة قطع من 590 نانومتر.
- إضافة 0.1٪ (ث / ت) سابونين لكل التالية أيضا القراءة الأولى والسماح لوحة لاحتضان لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة (مع هزاز) قبل قراءة لوحة للمرة الثانية في نفس الإعدادات.
- تحديد بالمئة غشاء permeabilization بشكل فردي لكل بئر بقسمة مضان الأولي القراءة (بعد المعالجة) من قبل مضان القراءة الثانية (بعد سابونين).
- ATP تحديد الفحص
- تطبيع مستويات البروتين في لست] عن طريق فحص BCA أو ما شابه ذلك (30).
- تحديد مستويات ATP الخلوية باستخدام طقم تقرير ATP القائم على التلألؤ أو ما يعادلها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تطبيع القيم المعالجة لعينات السيطرة المعافين المقابلة.
- LDH الفحص الإصدار
- بعد الإصابة، وجمع supernatants كما هو موضح في القسم 4.3.
- تقييم الإفراج LDH باستخدام طقم كشف السمية الخلوية لإطلاق رابطة حقوق الإنسان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
Representative Results
بروتوكول نظام العدوى القائم على إدراج نفاذية الأغشية المتقدمة لدراسة العوامل البكتيرية يفرز هو مفصل في الشكل 1. ويعتمد هذا النظام على الفصل بين البكتيريا والخلايا المضيفة عبر غشاء مسامي لتقييم آثار العوامل البكتيرية تفرز، في هذه الحالة ستربتوليزين S (SLS)، على استجابات المضيف مثل المضيف سلامة الغشاء، والسلامة الخلوية المتنقلة نقل الإشارة، والعوامل الخلية المضيفة يفرز الشكل 2 توفر بيانات الغربية وصمة عار التمثيلية مما يدل على أن هذا النظام يمكن أن تستخدم لتقييم التغيرات في تفعيل الاتصال مستقلة من المضيف يشير البروتينات. على وجه التحديد، وبيانات تمثيلية تظهر زيادة كبيرة تفعيل P38 MAPK في وجود سلالات غاز المنتجة للسلس. ويمكن أيضا أن هذا النظام سيتم تطبيقه على تصور آثار العوامل البكتيرية يفرز على توطين البروتين المضيف بواسطة المجهر المناعي (<قوي> الشكل 3). وتشير البيانات إلى تفعيل تعتمد SLS-الوسيط التهابات رئيسيا النووية عامل كابا B (عامل نووي معزز لسلسلة ضوء كابا في الخلايا البائية النشطة )، التي translocates من السيتوبلازم إلى نواة على تفعيل 21. وتشير النتائج في الشكلين 2 و 3 أن كلا SLS-تعتمد لا تتطلب استجابات إشارات التهابات الاتصال المباشر بين البكتيريا والخلايا المضيفة. كما أثبتت التجارب السابقة بالفعل قد أشارت SLS التي تعتمد P38 وتفعيل عامل نووي معزز لسلسلة ضوء كابا في الخلايا البائية النشطة في نماذج العدوى المباشرة 21، مستويات مماثلة من P38 أو تفعيل عامل نووي معزز لسلسلة ضوء كابا في الخلايا البائية النشطة بين سلالات GAS ثلاثة في النظام القائم على إدراج نفاذية الغشاء أن الاستجابة المطلوبة اتصال مباشر بين البكتيريا والخلايا المضيفة. ويوضح الشكل (4) أن هذا النظام العدوى يمكن تطبيقها لتقييم التغيرات التي تعتمد على السم في السمية الخلوية المضيف عبر homodimer إيثيديوم وإطلاق LDH المقايسات. ويتضح ذلك من الزيادة ط كبيرن على حد سواء غشاء permeabilization وفي الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان من الخلايا المضيفة تتعرض لضغوط الغازات التي تحتوي على SLS مقارنة مع الخلايا غير المصابة أو الخلايا المعرضة للإجهاد SLS التي تعاني من نقص. هذه التغييرات في السمية الخلوية ليست فورية، كما آثار كبيرة ليست واضحة حتى 12 ساعة بعد الإصابة في حالة permeabilization غشاء و 16 ساعة في حالة سراح LDH. وتوضح البيانات التمثيلية على أهمية اختيار نقطة زمنية مناسبة وظروف الإصابة لتقييم استجابات المضيف هذه. بالإضافة إلى السماح لتقييم يشير التغييرات المضيفة والسمية الخلوية، ونظام عدوى القائم على إدراج نفاذية الغشاء ينطبق على دراسة التغيرات الأيضية مثل تحديد دقيق لمستويات ATP المضيف عن طريق منع التلوث البكتيري لست] الخلية المضيفة (الشكل 5) . وتشير هذه البيانات إلى خسارة كبيرة للاعبي التنس المحترفين القرنية في الاستجابة للعدوى غاز بنسبة 16 ساعة بعد الإصابة، مع تعزيز فقدان ATP طن وجود سلس. هذه النتائج متسقة مع الزيادات احظ تعتمد على السم في مضيف إشارات الإجهاد استجابة والسمية الخلوية.
الشكل 1: بروتوكول نظام العدوى رسم تخطيطي نافذ غشاء إدراج استنادا إلى تقييم آثار العوامل البكتيرية يفرز في الخلايا المضيفة ومطلي الخلايا الكيراتينية الإنسان في حجرة أسفل ونمت إلى 90٪ التقاء. والكولاجين المغلفة الغشاء مع 0.4 ميكرون المسام يفصل بين الغرف العلوية والسفلية، وتضاف البكتيريا إلى الغرفة العليا من نظام إدراج نفاذية الغشاء لفترة العدوى المطلوب. قد تجمع supernatants زراعة الخلايا والخلايا المضيفة بعد فترة العدوى وتستخدم لمجموعة متنوعة من التحليلات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبرمن هذا الرقم.
الشكل 2: يمكن الاستفادة من نظام العدوى نافذ غشاء إدراج استنادا لالمضيف خلية تحليل المحللة بواسطة SDS-PAGE والتنشيف الغربية توضح بيانات تمثيلية SLS يعزز تفعيل المسار P38 MAPK في القرنية المصابة. أصيب (A) HaCaTs بالغاز لمدة 7 ساعة عن طريق نظام العدوى إدراج نفاذية الغشاء (في = زارة الداخلية 10)، وجرى تقييم لست] لتفعيل P38. تم تنفيذ (ب) كثافة من ثلاثة البقع مستقلة الغربية لتحديد تفعيل النسبي للP38 ردا على GAS'infection. ويبين متوسطات من ثلاثة مكررات البيولوجية، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. ويمثل تفعيل النسبي للP38 كما / مستويات البروتين الكلي فسفرته. تم تحديد دلالة إحصائية مقارنة لالخلايا غير المصابة. تم تحديد قيمة ص الشاملة التي ANOVA (ع = 0.0063). أجريت اختبارات Dunnett في مرحلة ما بعد خاصة لمقارنة كل حالة على السيطرة المعافين المقابلة يعني. * ص = 0،01-0،05. **، ص = ،001-،01. ***، ص = ،0001-،001. ****، ف <0.0001. تم تعديل هذا الرقم من فلاهيرتي وآخرون. 2015 21. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): يسمح للنظام العدوى نافذ غشاء إدراج القائم على لتصور التغييرات اشارة المضيف عن طريق المناعي المجهري وتشير البيانات التمثيلية التي ستربتوليزين S يعزز الإشارات الموالية للالتهابات من خلال تفعيل عامل نووي معزز لسلسلة ضوء كابا في الخلايا البائية النشطة . أصيب HaCaT الخلايا الكيراتينية الإنسان مع غاز في أحد M منظمة أوكسفام الدولية من 10 إلى 8 ساعات باستخدام نظام العدوى أساس إدراج غشاء منفذ. تم تقييم (A و B) توطين النووي للعامل نووي معزز لسلسلة ضوء كابا في الخلايا البائية النشطة بواسطة التصوير المناعي. تم حساب النسبة المئوية للخلايا محلية النووية من خلال إحصاء عدد الخلايا التي عامل نووي معزز لسلسلة ضوء كابا في الخلايا البائية النشطة قد translocated من السيتوبلازم إلى نواة لحقل معينة وقسمة هذا العدد على العدد الكلي للخلايا لنفس الحقل. وتشير الحانات مقياس 100 ميكرون. (A) وبمعدل ثلاثة مكررات البيولوجية تتمثل لكل حالة مع أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. تم تحديد قيمة ص الشاملة التي ANOVA. ف <0.0001. أجريت اختبارات Dunnett لمقارنة كل حالة إلى حالة السيطرة المعافين المقابلة. * ص = 0،01-0،05. **، ص = ،001-،01. ***، ص = ،0001-،001. ****، ف <0.0001. تم تعديل هذا الرقم من فلاهيرتي وآخرون. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: يسمح نظام العدوى نافذ غشاء إدراج وبناء من أجل تحديد البكتيرية بوساطة غشاء Permeabilization والسمسة في غياب الاتصال المباشر بين البكتيريا وخلايا المضيف توضح بيانات تمثيلية الجدوى القرنية النقصان في وجود نشط السم SLS . GAS - تم تقييم الناجم عن موت الخلايا في الخلايا HaCaT بحضور WT، SLS-ناقصة أو الملحمة غاز تستكمل تعرضت الخلايا الكيراتينية للغاز باستخدام نظام العدوى القائم على إدراج نفاذية الغشاء ل8-16 ساعة على وزارة الداخلية من 10. (. أ) تم تقييم الجدوى عن طريق فحص إيثيديوم homodimer أو (ب) رابطة حقوق الإنسان الإفراج الفحص. في كلا الفريقين، 3 إعادةوبلغ متوسط plicates وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. تم تحديد أهمية كل نقطة زمنية من قبل ANOVA (A) 8 ساعة، ص = 0.0241. 12 ساعة، ف <0.0001 (B) 8 ساعة، ص = 0.0287. 12 ساعة، ص = 0.1977. 16 ساعة، ص = 0.0031. أجريت اختبارات Dunnett لمقارنة الوسائل من كل حالة للعدوى من النوع البري لنقطة زمنية المقابلة. * ص = 0،01-0،05. **، ص = ،001-،01. ***، ص = ،0001-،001. ****، ف <0.0001. تم تعديل هذا الرقم من فلاهيرتي وآخرون. 2015 21. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: يسمح نظام العدوى نافذ غشاء إدراج استنادا لتحديد دقيق لمستويات المضيف ATP عن طريق منع جرثومةيريال تلوث الخلية المضيفة لست]. وتوضح بيانات تمثيلية فقدان تعتمد SLS-من ATP خلال عدوى المجموعة. والخلايا المصابة HaCaT مع غاز ل16/08 ساعة باستخدام نظام العدوى أساس إدراج غشاء منفذ. مكررات التقنية (ن = 3) من تكرار البيولوجي ممثل واحد (2 × 10 6 خلايا في العينة) وبلغ متوسط لكل حالة، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. تم تحديد القيم ف الشاملة التي ANOVA (12 ساعة، ف <0.0001 و 16 ساعة، ف <0.0001). أجريت اختبارات Dunnett لمقارنة كل حالة مع الإصابة من النوع البري لنقطة زمنية المقابلة. * ص = 0،01-0،05. **، ص = ،001-،01. ***، ص = ،0001-،001. ****، ف <0.0001. تم تعديل هذا الرقم من فلاهيرتي وآخرون. 2015 21. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا يتم وصف أسلوب باستخدام غشاء النظام العدوى قابلة للاختراق القائم على إدراج لدراسة آثار السم البكتيري ستربتوليزين S على القرنية الطلائية الإنسان في النظام في المختبر. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة عوامل الفوعة البكتيرية يفرز الأخرى، وكذلك أنواع الخلايا المضيفة البديلة. ويوفر هذا النظام وضعت مؤخرا العديد من المزايا أكثر من الأساليب التجريبية التي تستخدم السموم النقاء أو supernatants البكتيرية التي تمت تصفيتها 1 - 3،8،18 - 20. ويوفر هذا النظام قابلة للاختراق على أساس إدراج غشاء جرعة حافظت باستمرار للسموم البكتيريا ذات الصلة لاستضافة الخلايا كما يتم إنتاجه، والذي يسمح النشاط السم القصوى التي يتعين الحفاظ عليها وأيضا يزيد من تناسق بين التجارب. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام تحاكي بشكل وثيق الظروف الفسيولوجية من خلال السماح للعامل يفرز تتراكم مع مرور الوقت كما تقدم العدوى وeliminating الحاجة لتحديد تعسفي تركيز السم محددة لتطبيقها على الخلايا المضيفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام أيضا أن يكون وسيلة للمحققين لتقييم ما إذا كان يتم تسليم أحد العوامل البكتيرية التي تهم الخلايا المضيفة بطريقة تعتمد على الاتصال. في كثير من الأحيان اختبار الاتصال الاعتماد من خلال جيل من المسوخ البكتيرية إسوي نقص في الالتزام أو من خلال استخدام الكواشف التي تحول دون التزام. ان النظام المذكور هنا توفر بديلا بسيط لتكمل أو استبدال هذه الأساليب التقليدية.
بالإضافة إلى تطبيقات اختبار هو موضح في القسم 5 من البروتوكول، والتطبيقات الأخرى التي هذا النظام العدوى يمكن أن تتكيف بسهولة تشمل جمع العينات لصفائف خلوى والمقايسات إليسا. في كل من هذه الحالات، يمكن اتباع بروتوكول مماثل لتلك التي وصفها لفحوصات الإفراج LDH. وإن لم يكن هو موضح هنا، وقد استخدم هذا النظام لجمع عينات بشكل فعال الخلية المضيفة أن يكونnalyzed التدفق الخلوي. في هذا التطبيق، تتم إزالة إدراج نفاذية الغشاء بعد فترة العدوى، ويتم غسل الخلايا لإزالة مستنبت الخلية، ويتم تطبيق التربسين السماح مجموعة من الخلايا لتحليلها. الفصل المادي من البكتيريا من الخلايا المضيفة مفيد بشكل خاص لهذا التطبيق لأنه يساعد على منع تكوين مجاميع كبيرة تتألف من البكتيريا الالتزام والخلايا المضيفة التي يمكن أن تتداخل خلاف مع عد الخلايا دقيق من خلال قياس التدفق الخلوي.
على الرغم من أن لوحظ استجابة المضيف متسقة للغاية عند مقارنة نتائج نفاذية الغشاء القائم على إدراج الدراسات الإصابة بفيروس دراسات عدوى التقليدية المباشرة، وقد لوحظ بعض الاختلافات الملحوظة في حركية ردود المضيف هذه 21. على سبيل المثال، التغييرات في إشارة المضيف وغشاء القائم على السمسة تأخذ 30-50٪ وقتا أطول للتحدث في نفاذية الغشاء نموذج العدوى القائم على إدراج من كورالاستجابة نماذج إصابة مباشرة. لأن الغشاء النظام القائم على إدراج نفاذية يتطلب المتوسطة ليتم تطبيقها على المقصورات العلوية والسفلية من كل جانب، ونظام متطور للدراسات الموصوفة هنا يتطلب زيادة بنسبة 30٪ في إجمالي حجم المتوسط في مقابل جيد لالمقابل نماذج العدوى المباشرة المستخدمة سابقا 21. هذا الاختلاف في إجمالي حجم المتوسط، إلى جانب زيادة المسافة بين البكتيريا والخلايا المضيفة عندما يحظر الاتصال المباشر، من المرجح أن يزيد من الوقت الذي يستغرقه لSLS لنشر من خلال وسيلة للوصول إلى الخلايا المضيفة والحصول على الآثار الملاحظة. بالإضافة إلى ذلك، فإن النظام نفاذية أساس إدراج غشاء يزيل العديد من العوامل غاز الفوعة التي من المحتمل أن تسهم في استضافة تلف الخلايا. غياب هذه العوامل الإضافية في هذا النظام قد يسهم في تأخير المضيف موت الخلايا وبدء الأحداث المضيف يشير مقارنة للإصابة المباشرة 21 أيضا. وينبغي النظر في هذه العواملعند تصميم التجارب لتقييم مكونات بكتيرية يفرز أخرى.
للتعرف على الظروف الأكثر وضوحا لاختبار آثار العوامل البكتيرية يفرز في الخلايا المضيفة، واختبار مجموعة من النقاط الزمنية لكل تطبيق نظام العدوى القائم على إدراج نفاذية الغشاء يوصى. من المهم النظر في ماهية الظروف عامل الفوعة معين من الفائدة تنتج على النحو الأمثل (على سبيل المثال مرحلة السجل، مرحلة ثابتة، في استجابة لإشارات بيئية معينة، وما إلى ذلك) من أجل مراقبة بنجاح آثاره. في التجارب التي تركز على تقييم التغيرات في البروتينات المضيف يشير، كان من الضروري لتحديد نقاط الوقت الذي يسمح الوقت الكافي لSLS للوصول إلى الخلايا المضيفة وإلى أن يتم إنتاجها بكميات كافية للحث على إشارات تغيير 21. في نفس الوقت، وتقييم التغييرات في المضيف يشير حاجة إلى أن تتم قبل permeabilization غشاء الناجم عن SLS، لأن ذلك أثر جomplicates جمع لست] الخلية المضيفة لتحليلها. موت الخلايا الناجم عن SLS يمكن ملاحظة على النحو الأمثل في كل غشاء المباشر ونفاذية نماذج العدوى القائم على إدراج بعد عدة ساعات من بدء الأحداث يشير ذكرت 21. وعلاوة على ذلك، في اختيار الوقت من نقاط الاهتمام، فمن المهم أيضا ضمان أن البكتيريا التي تجري دراستها غير قادرة على اختراق الغشاء إدراج يسهل اختراقها خلال فترة الدراسة. إنتاج بعض المكونات البكتيرية على مدى فترة طويلة قد تعرقل سلامة الغشاء وتسمح بمرور البكتيريا إلى المقصورة أقل. لتحديد ما إذا كان هذا هو وجود مشكلة محتملة في نظام الفائدة، ويمكن تطبيق السلالات البكتيرية التي يتعين دراستها إلى الغرفة العليا من نظام نفاذية أساس إدراج غشاء على مجموعة من النقاط الزمنية. في كل نقطة زمنية، وإدراج يمكن إزالتها بعناية والمتوسطة من الغرفة السفلى يمكن جمعها والاستفادة منها في التعاون مستعمرة القياسيةفحص unting (انظر القسم 1.5). إذا لم تتشكل أي مستعمرات من مستنبت الخلية في المقصورة أقل، يمكن افتراض الغشاء إدراج إلى أن منع بشكل فعال مرور البكتيريا في نقطة زمنية والحمولة الجرثومية التي تم اختبارها.
عنصر آخر التصميم التجريبي الذي من المرجح أن تتطلب الأمثل للتحليل الفعال للعوامل الجرثومية يفرز هو وافر من العدوى (وزارة الداخلية). تشير وزارة الداخلية إلى نسبة الخلايا البكتيرية في الخلية المضيفة، وبالتالي يتأثر confluency الخلية المضيفة في وقت الإصابة وعدد من مستعمرة بكتيرية (كفو) يتم تطبيقها على الخلايا. في هذه الدراسات، وقد نمت الخلايا الكيراتينية إلى 90٪ confluency، الذي سمح لهذه الخلايا لتشكيل أحادي الطبقة متماسكة مع منعطفات ضيقة سليمة. دراسة متأنية للمنظمة الفسيولوجية للخلايا المضيفة إلى دراسة ضروري لتحديد confluency المناسب لإجراء التجارب العدوى. مرة واحدة في approprعدد iate من الخلايا المضيفة في يتحدد بشكل جيد، وهو كفو البكتيرية مناسبة يمكن أن تحسب على أساس قبالة وزارة الداخلية المطلوبة. في الدراسات الموصوفة هنا، تم تطبيق غاز إلى الخلايا المضيفة في وزارة الداخلية من 10. مناسبة زارة الداخلية سوف تختلف مع بكتيريا مختلفة والتحليلات المتابعة المطلوبة. وبداية منخفضة وزارة الداخلية هو عادة أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ويسمح للعامل البكتيريا التي تهم تتراكم ببطء بما فيه الكفاية لالتقاط بعض التغييرات الطفيفة في إشارة الخلية المضيفة قبل تغييرات جذرية في بقاء الخلية المضيفة هي واضح. وتستخدم موييس العليا في العديد من الدراسات التي تقيم السمية الخلوية، ولكن يمكن أيضا أن هذا التأثير أن يتحقق من خلال البدء مع وزارة الداخلية منخفضة والسماح للالعدوى إلى التقدم لفترة أطول من الزمن. ومن المهم لتحديد كفو دقيقة إلى النتيجة الطبيعية الكثافة البصرية لجميع السلالات البكتيرية لفحصها، كما المسوخ إسوي قد يكون لها معدل نمو تغير مقارنة البرية من نوع البكتيريا، وبالتالي قد تتطلب أن تضاف إليها كفو أعلى أو أقل لكل بئر لضمان المقارنة المناسبة للاستجابة المضيف بين السلالات. في الحالات التي تكون فيها الخلايا المضيفة الثدييات التي تجري دراستها هي قادرة على قتل البكتيريا أو تمنع نموها أو إذا اشتبه النمو nonsynchronous بين السلالات البكتيرية، فإنه قد يكون من المفيد إجراء دراسات لتقييم الحمل البكتيري النهائي في نهاية فترة العدوى أيضا. هذا يمكن أن يتحقق من خلال جمع محتويات إدراج قابلة للاختراق وأداء مستعمرة العد فحص مماثلة لتلك التي وصفها في القسم 1.5 من هذا الإجراء.
اختيار الآبار بحجم مناسب للفحص المطلوب من المهم للحصول على أفضل النتائج أيضا. هي إدراج غشاء نفاذية متاحة في مجموعة متنوعة من الأحجام، ولكن لوحظت نتائج أكثر اتساقا للدراسات هو موضح هنا باستخدام إدراج مصممة لمدة 24 جيدا و 6 لوحات زراعة الأنسجة بشكل جيد. هذه الأحجام إدراج سهلة نسبيا للتعامل مع ملقط معقم، وسهولة التلاعب أمر بالغ الأهمية في منعجي نقل غير المرغوب فيها من البكتيريا من المقصورة العليا إلى المقصورة أقل من البئر. لالتجارب التي تنطوي على جمع لست] الخلية المضيفة، وتوفر 6 أطباق جيدا على عدد الخلايا المناسب لكل حالة لمعظم التحليلات وكبيرة بما يكفي لاستيعاب كاشطات خلية لجمع العينات. لفحوصات السمية الخلوية حيث تقوم الخلايا المضيفة لا تزال ملتصقة وصفت مع الفلورسنت أو صبغ colorometric التي يمكن قياسها على قارئ لوحة (على سبيل المثال إيثيديوم homodimer الفحص، التريبان مقايسة الاستبعاد الزرقاء)، واستخدام 24 لوحة جيدا مع إدراج المقابلة هو موصى به. لالتجارب التي مستنبت الخلية سيتم جمعها وتحليلها (على سبيل المثال إطلاق رابطة حقوق الإنسان، دراسات خلوى) إما 24 جيدا أو 6 لوحات جيدا يمكن أن تستخدم، على الرغم من أن الآبار الصغيرة عادة ما توفر كميات عينة كافية لهذه التحليلات وتقليل استخدام المطلوبة الكواشف. وعموما، فإن هذه الطريقة تنوعا للغاية ويمكن تكييفها حسب الحاجة لإعداد sampl الدراسيوفاق للعديد من التطبيقات المتابعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
| Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
| HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
| 10 cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
| 6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| 24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
| Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
| Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
| Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
| Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
| Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
| Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
| Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ml | |
| Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
| LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
| Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
| DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
| Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
| Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |
References
- Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).
- Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314 (2011).
- Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970 (2012).
- Sumitomo, T., Nakata, M., et al. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).
- Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).
- Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).
- Stassen, M., Müller, C., et al. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).
- Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).
- Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).
- Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).
- Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).
- Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).
- Datta, V., Myskowski, S. M., et al. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).
- Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).
- Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).
- Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).
- Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).
- Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).
- Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).
- Gangl, K., Waltl, E. E., et al. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).
- Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).
- Zheng, Y., Guo, J., et al. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49 (2015).
- Losa, D., Köhler, T., et al. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).
- Cook, K. W., Letley, D. P., et al. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
