Summary
इधर, एक विधि Streptolysin एस, ग्रुप ए स्ट्रेप्टोकोकस द्वारा उत्पादित एक स्रावित विष के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली का उपयोग कर, केरेटिनकोशिकाओं पर वर्णित है। इस प्रणाली को आसानी से संक्रमण के दौरान विभिन्न प्रकार मेजबान सेल पर अन्य secreted बैक्टीरियल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों शक्तिशाली विषाक्त पदार्थों को मेजबान ऊतक के विनाश में सहायता करने के लिए, मेजबान कोशिकाओं में संकेत परिवर्तन शुरू करने के लिए या संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रियाएं हेरफेर करने के लिए छिपाना। तरीकों को सफलतापूर्वक शुद्ध करने के लिए विकसित किया गया है हालांकि और इन महत्वपूर्ण विषैलापन कारकों में से कई का उत्पादन, अभी भी कई जीवाणु विषाक्त पदार्थों जिसका अनोखी संरचना या व्यापक बाद translational संशोधनों उन्हें शुद्ध और इन विट्रो प्रणालियों में अध्ययन करने के लिए मुश्किल बना रहे हैं। इसके अलावा, यहां तक कि जब शुद्ध विष प्राप्त किया जा सकता है, वहाँ प्रासंगिक शारीरिक शर्तों के तहत एक विष के विशिष्ट प्रभाव का अध्ययन करने के साथ जुड़े कई चुनौतियों का सामना कर रहे हैं। मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में सबसे विष की एक बार की खुराक के साथ मेजबान कोशिकाओं incubating शामिल है। इस तरह के तरीकों खराब एक संक्रमण है, जहां विष लगातार द्वारा निर्मित है के दौरान क्या मेजबान कोशिकाओं को वास्तव में अनुभव अनुमानितबैक्टीरियल कोशिकाओं और संक्रमण के दौरान धीरे-धीरे जमा करने के लिए अनुमति दी। इस प्रोटोकॉल एक पारगम्य झिल्ली डालने आधारित जीवाणु संक्रमण प्रणाली के डिजाइन मानव उपकला केरेटिनकोशिकाओं पर Streptolysin एस, एक शक्तिशाली विष ग्रुप ए स्ट्रेप्टोकोकस द्वारा उत्पादित, के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वर्णन करता है। इस प्रणाली को और अधिक बारीकी तरीकों जहां शुद्ध विष या बैक्टीरियल supernatants सीधे कोशिकाओं की मेजबानी के लिए लागू कर रहे हैं की तुलना में एक संक्रमण के दौरान प्राकृतिक शारीरिक पर्यावरण mimics। महत्वपूर्ण बात, इस विधि को भी मेजबान प्रतिक्रियाएं कि बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच संपर्क को निर्देशित करने के कारण कर रहे हैं के पूर्वाग्रह को समाप्त। इस प्रणाली को प्रभावी ढंग से मेजबान झिल्ली अखंडता, सेलुलर व्यवहार्यता, और सेलुलर संकेत प्रतिक्रियाओं पर Streptolysin एस (एसएलएस) के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया है। इस तकनीक को आसानी से एक स्रावित बैक्टीरियल कारक डी की विशिष्ट भूमिका की जांच करने के स्तनधारी मेजबान सेल प्रकार की एक किस्म पर अन्य स्रावित विषैलापन कारकों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकतासंक्रमण के पाठ्यक्रम uring।
Introduction
मेजबान सेल संक्रमण के संदर्भ में बैक्टीरियल विषैलापन कारकों के समारोह को समझना बैक्टीरियल रोगजनन अनुसंधान के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित है। 10 - कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सक्रिय रूप से मेजबान ऊतक के विनाश में सहायता करने के लिए, मेजबान कोशिकाओं में संकेत परिवर्तन शुरू करने के लिए या संक्रमण 1 के दौरान प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रियाएं हेरफेर करने के लिए विषाक्त पदार्थों और अन्य घुलनशील कारकों छिपाना। तरीकों को सफलतापूर्वक शुद्ध करने के लिए विकसित किया गया है हालांकि और अध्ययन के लिए इन महत्वपूर्ण विषैलापन कारकों में से कई का उत्पादन, कुछ जीवाणु उत्पादों अद्वितीय संरचनाओं या व्यापक बाद translational संशोधनों कि शुद्धि के तरीकों के लिए उन्हें अड़ियल उम्मीदवारों बनाने के लिए और इस प्रकार इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग करते हुए अलगाव में अध्ययन नहीं किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, ग्रुप ए स्ट्रेप्टोकोकस, जीवाणु रोगज़नक़ ग्रसनीशोथ से नेक्रोटाइज़िंग fasciitis और विषाक्त आघात सिंड्रोम से लेकर संक्रमण की एक बहुत बड़ी संख्या के लिए जिम्मेदार है, एक स्रावित का उत्पादनबैक्टीरियल विष Streptolysin एस (एसएलएस) 11 के रूप में जाना जाता है - 17। इस ribosomally उत्पादित पेप्टाइड Streptolysin एस जुड़े जीन (एसएजी) क्लस्टर द्वारा इनकोडिंग है, और परिपक्व उत्पाद का आकार 14 में 2.7 केडीए होने का अनुमान है - 17। Protoxin, सागा द्वारा इनकोडिंग, कई एंजाइमों (SagB, SagC, और SAGD) द्वारा पोस्ट-translationally संशोधित किया गया है परिपक्व, कार्यात्मक फार्म का उत्पादन करने के लिए 15 - 17। विष का असामान्य अमीनो एसिड अनुक्रम के साथ मिलकर इन बाद translational संशोधनों की जटिलता विष है कि आज तक 15,17 का प्रयास किया गया है सभी शुद्धि और संरचना व्याख्या के प्रयासों के साथ असंगत प्रदान की गई है। इन चुनौतियों का मेजबान रोगजनन में इस विष की विशिष्ट भूमिका निर्धारित करने के लिए जटिल प्रयासों की है।
मामलों में जहां शुद्ध विषाक्त पदार्थों या अन्य स्रावित कारकों की तैयारी या तो जटिल या संभव नहीं है, के लिए तंत्र मेंस्पष्ट इन उत्पादों के समारोह में परंपरागत रूप से छान बैक्टीरियल supernatants, जो तब कोशिकाओं 18 की मेजबानी के लिए लागू कर रहे हैं की तैयारी के माध्यम से अध्ययन किया गया है - 20। इस तकनीक के साथ जुड़े कई चुनौतियों का सामना कर रहे हैं। सबसे पहले, इन स्रावित कारकों, एसएलएस सहित कई, अधिक से अधिक या लगातार गतिविधि जब संग्रहीत और बाद में कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए लागू बनाए रखने के लिए नहीं है। साथ ही, जब supernatants एक भी समय बिंदु पर एकत्र कर रहे हैं और फिर कोशिकाओं की मेजबानी के लिए आवेदन किया है, यह मुश्किल है शारीरिक प्रासंगिकता का निर्धारण करने के लिए और प्राकृतिक संक्रमण प्रक्रिया है, जहां secreted कारकों संक्रमण के पाठ्यक्रम एक करने के दौरान जमा करने के लिए अनुमति दी जाती है के बारे में सीधा निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए physiologically प्रासंगिक एकाग्रता। 3,8 - यह दूसरी चुनौती न केवल बैक्टीरियल supernatants का उपयोग करने के लिए, लेकिन यह भी मेजबान सेल के अध्ययन 1 में शुद्ध विषाक्त पदार्थों का उपयोग करने के लिए लागू होता है। इन मुद्दों, एक पारगम्य झिल्ली INSE संबोधित करने के लिएRT-आधारित संक्रमण प्रणाली एक तरह से है कि इष्टतम विष गतिविधि को बनाए रखता है और यह भी बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच सीधे संपर्क के चर समाप्त में मेजबान कोशिकाओं पर एसएलएस के प्रभाव का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है। इस प्रणाली में, मानव उपकला कोशिकाओं में अच्छी तरह से एक दो कक्ष के नीचे कक्ष में एक monolayer में बड़े हो रहे हैं, और बैक्टीरिया ही अच्छी तरह के ऊपरी सदन में पेश कर रहे हैं। एक झरझरा झिल्ली (0.4 माइक्रोन pores) ऊपरी और निचले कक्षों को अलग करती है, की अनुमति secreted कारकों दो कक्षों के बीच आदान-प्रदान किया जा सकता है लेकिन बैक्टीरिया के पारित होने को रोकने। इस प्रणाली के मेजबान प्रतिक्रियाओं है कि केवल निरंतर स्रावित बैक्टीरियल घटकों के कारण होते हैं किसी भी प्रतिक्रियाओं ग्रुप ए streptococcal संक्रमण के दौरान सीधे संपर्क के माध्यम से हो सकता है कि नष्ट करते हुए की प्रभावी मूल्यांकन के लिए अनुमति दी गई है। एसएलएस के अलावा अन्य स्रावित बैक्टीरियल कारकों को भी झरझरा झिल्ली के माध्यम से पारित कर सकते हैं हालांकि, जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) सहित एक isogenic उत्परिवर्ती पैनल का उपयोग करते हैं, एक एसएलएस के.एन.ockout (ΔsagA) और एक गाथा पूरित तनाव (ΔsagA + कथा) मेजबान प्रतिक्रियाओं है कि कड़ाई से एसएलएस निर्भर हैं 21 की सटीक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।
हालांकि समान पारगम्य झिल्ली डालने सिस्टम स्रावित वायरल संक्रमण में शामिल घटकों, कैंसर जीव विज्ञान, और प्रतिरक्षा सेल प्रवास 22 के अध्ययन के लिए नियोजित किया गया है - 26, कुछ अध्ययनों मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल बातचीत से जुड़े इस दृष्टिकोण 6,27,28 का उपयोग किया है। यहाँ तक कि अध्ययन है कि बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इस तरह की व्यवस्था कार्यरत है मुख्य रूप से पारगम्य झिल्ली डालने पर चढ़ाया एक उपकला या endothelial monolayer के माध्यम से भड़काऊ कोशिकाओं या बैक्टीरिया के प्रवास पर ध्यान केंद्रित किया है। पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली के साथ साथ वर्णित एक सरल और प्रभावी तरीका है कि एक झरझरा झिल्ली प्रभावी तरीके का आकलन करने के माध्यम से बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं की जुदाई पर निर्भर करता हैsecreted विष, एसएलएस, मेजबान झिल्ली अखंडता, सेलुलर व्यवहार्यता, सेलुलर संकेत पारगमन, और secreted मेजबान सेल कारकों पर की सीटीएस। इस तकनीक में एक संक्रमण के पाठ्यक्रम पर एक विशिष्ट जीवाणु कारक की भूमिका की जांच करने के लिए स्तनधारी मेजबान सेल प्रकार की एक किस्म पर अन्य स्रावित विषैलापन कारकों के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
1. जीवाणु संस्कृति
- Isogenic उत्परिवर्ती उपभेदों उत्पन्न ब्याज 21 के विशिष्ट स्रावित कारक के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
नोट: GASM1T1 5448 उपभेदों इन प्रयोगों में शामिल है के लिए उपयोग गुम्मट गैस ', एक गाथा Δ बिल्ली एसएलएस की कमी उत्परिवर्ती (Δ गाथा के रूप में पाठ में संक्षिप्त), और एक गाथा पूरित तनाव 21 (Δ गाथा + गाथा के रूप में पाठ में संक्षिप्त)। - ब्याज की जीवाणु उपभेदों की रात तरल संस्कृतियों तैयार करें। 16-20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गैस M1T1 बढ़ो टोड-हेविट शोरबा के -10 मिलीलीटर में 5448 उपभेदों मानव कोशिकाओं को संक्रमित करने से पहले।
- ताजा जीवाणु माध्यम में अपकेंद्रित्र रातोंरात जीवाणु संस्कृतियों (10 मिनट के लिए 2,400 आरसीएफ) और resuspend।
नोट: एक ही मात्रा में मेजबान के रूप में रात भर संस्कृतियों (5-10 मिलीग्राम) में बड़े हो रहे थे आम तौर पर एक वांछनीय प्रारंभिक ऑप्टिकल घनत्व पैदा करता है। - बैक्टीरियल संस्कृतियों को सामान्यसभी उपभेदों (ओवर ड्राफ्ट लगभग 1.0 के 600 सुविधा के लिए सिफारिश की है) का परीक्षण किया जा करने के लिए 600 एनएम (आयुध डिपो 600) पर एक ही ऑप्टिकल घनत्व जब तक अतिरिक्त बैक्टीरियल माध्यम में फिर से निलंबित संस्कृतियों गिराए द्वारा बराबर शुरुआती सांद्रता प्राप्त की है।
नोट: इन अध्ययनों में, स्थिर चरण बैक्टीरियल संस्कृतियों तुरंत सामान्य बनाने के बाद मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। हालांकि, बैक्टीरिया से बाहर निकलें स्थिर चरण के कुछ उपभेदों के रूप में nonsynchronously यह अधिक उपयुक्त है, तो इस ब्याज के तनाव के लिए मामला हो पाया है लॉग चरण संस्कृतियों के साथ मेजबान के संक्रमण शुरू करने के लिए हो सकता है। - आगे के विश्लेषण के लिए पहले, परख गिनती शुरू संस्कृतियों में मिली लीटर प्रति वर्तमान कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) निर्धारित करने के लिए इतना है कि संक्रमण की बहुलता (MOI), या मेजबान सेल प्रति बैक्टीरिया का अनुपात निर्धारित किया जा सकता है एक कॉलोनी प्रदर्शन करते हैं।
- 1 मिलीलीटर बैक्टीरियल संस्कृतियों है कि वांछित ऑप्टिकल densi के लिए सामान्यीकृत कर दिया है के धारावाहिक dilutions तैयारTy फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या उचित बैक्टीरियल मध्यम विकास में (टोड-हेविट शोरबा इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था)। से 10 -1 10 -6 के लिए गणनीय कालोनियों (30-300 कालोनियों) के साथ अगर प्लेटों के कम से कम एक सेट का उत्पादन करने के लिए लेकर dilutions तैयार करें। तीन प्रतियों में सभी dilutions प्रदर्शन करना।
- एक अगर बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए उपयुक्त माध्यम युक्त थाली विश्लेषण किया जा रहा पर प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के 100 μl स्थानांतरण।
नोट: टोड-हेविट अगर इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था। - एक कांच या प्लास्टिक बैक्टीरियल स्प्रेडर का प्रयोग समान रूप से अगर प्लेट की पूरी सतह भर में 100 μl विभाज्य वितरित, और जब तक तरल अगर में समाहित कर दिया गया है फैल रहा जारी रखने के लिए। बाँझ तकनीक का उपयोग लौ में प्रदर्शन।
- रात भर या जब तक गणनीय कालोनियों दिखाई देते हैं 37 डिग्री सेल्सियस पर अगर प्लेटें सेते हैं।
- कालोनियों कि एक थाली पर बढ़ने की गणना करें और निम्न formu द्वारा मूल संस्कृति में CFU / एमएल की गणनाla: कालोनियों की संख्या x धारावाहिक कमजोर पड़ने / संस्कृति मिलीलीटर मात्रा में चढ़ाया का उलटा।
जैसे (200 कालोनियों x 1/10 -5 कमजोर पड़ने) / 0.1 मिलीलीटर चढ़ाया = 2.0 x 10 8 CFU / एमएल
2. होस्ट सेल संस्कृति
- वांछित विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त मेजबान सेल लाइन प्राप्त करते हैं।
नोट: HaCaT मानव उपकला केरेटिनकोशिकाओं 29, वी Nizet से एक तरह का उपहार, इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया।- Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ (एफबीएस) में 100 मिमी संस्कृति बर्तन में HaCaT कोशिकाओं को बनाए रखें। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
पारगम्य झिल्ली सम्मिलित प्रणाली के साथ 3. मेजबान कोशिका संक्रमण
- उचित टिशू कल्चर व्यंजन में प्लेट कोशिकाओं और जब तक वे 90% confluency तक पहुंचने के लिए उन्हें विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
नोट: इन अध्ययनों में इस्तेमाल आम तौर पर 2-3 डी confluency तक पहुँचने HaCaT कोशिकाओंचढ़ाना के बाद ays।- Lysate संग्रह के लिए (संकेत विश्लेषण और adenosine triphosphate (एटीपी) दृढ़ संकल्प assays उदाहरण के लिए), / अच्छी तरह से लगभग 3 x 10 5 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व पर 6 अच्छी तरह से बर्तन में HaCaT कोशिकाओं थाली।
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रयोगों, लगभग 3 x 10 5 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से बर्तन के भीतर बाँझ कांच coverslips पर थाली कोशिकाओं के लिए।
- Ethidium homodimer झिल्ली permeabilization और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) रिलीज assays के लिए, / अच्छी तरह से लगभग 5 x 10 4 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व में 24 अच्छी तरह से बर्तन में HaCaT कोशिकाओं थाली।
- इसके तत्काल इलाज के लिए पहले, 1x बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- कोशिकाओं को नए सिरे से मध्यम विकास को लागू करें। यहाँ वर्णित शर्तों के लिए, 6 अच्छी तरह प्लेटें या 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति 0.5 मिलीलीटर माध्यम के लिए अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर मध्यम लागू होते हैं। औषधीय उपचार परीक्षण किया जा रहा रहे हैं, ताजा माध्यम के साथ मिश्रण है और इस काएं के दौरान लागूपी।
नोट: कुछ assays वैकल्पिक मीडिया आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, फिनोल के रूप में लाल और उच्च सांद्रता सीरम LDH रिलीज परख के साथ हस्तक्षेप, फिनोल लाल मुक्त DMEM 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) (डब्ल्यू / वी), 2 मिमी एल glutamine के साथ पूरक है, और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट था इन प्रयोगों के लिए उपयोग किया। - बाद नए सिरे से मध्यम लागू किया गया है, ध्यान से प्रत्येक में एक बाँझ 0.4 माइक्रोन पारगम्य झिल्ली डालने अच्छी तरह से जगह है। एक लामिना का प्रवाह हुड में इस कदम प्रदर्शन, और अच्छी तरह से प्रत्येक में पारगम्य झिल्ली डालने के हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक कुएं के ऊपरी सदन के लिए नए सिरे सेल संस्कृति के माध्यम से लागू करें। यहाँ वर्णित शर्तों के लिए, 6 अच्छी तरह प्लेटें या 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति 0.1 मिलीलीटर माध्यम के लिए अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर मध्यम लागू होते हैं।
- सामान्यीकृत बैक्टीरियल संस्कृतियों (खंड 1 देखें) पारगम्य झिल्ली डालने प्रणाली के ऊपरी सदन के एक उचित मात्रा को लागू करें। असंक्रमित contr के लिए जीवाणु माध्यम का उपयोगराजभाषा उपचार। यहाँ वर्णित परिणामों के लिए, 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए चैम्बर प्रति सामान्यीकृत संस्कृतियों के 25 μl जोड़ें और 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए चैम्बर प्रति संस्कृतियों के 100 μl जोड़ें।
नोट: इन अध्ययनों में, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती गैस कोशिकाओं की मेजबानी के लिए लागू किया गया था पर 10 MOI के एक MOI अंतिम यूकेरियोटिक सेल नंबर के आधार पर गणना की गई है (उदाहरण के लिए 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से), ऐसा है कि 10 बार के रूप में कई बैक्टीरिया संक्रमण अवधि की शुरुआत (जैसे 2 एक्स में मेजबान सेल प्रति जोड़ा गया था अच्छी तरह से प्रति 10 7 CFU)। उचित MOI विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु के साथ और वांछित अनुवर्ती विश्लेषण के साथ अलग अलग होंगे।
नोट: असंक्रमित नियंत्रण, इस तकनीक के कुछ अनुप्रयोगों गर्मी की मौत हो बैक्टीरिया या तुलना के लिए खर्च बैक्टीरियल मध्यम शामिल हो सकते हैं के लिए अन्य उपयोगी नियंत्रण के लिए जीवाणु माध्यम का उपयोग करने के अलावा। - 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को सेते हैं।
4. नमूना संग्रह
<राजभाषा>- 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में निचले सदन से मध्यम लीजिए। संग्रह के दौरान monolayer को परेशान करने से बचें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र नमूने सेलुलर मलबे को हटाने के लिए।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और स्टोर करने के लिए, लेकिन सभी सतह पर तैरनेवाला के 50 μl निकालें या तुरंत का उपयोग करें।
- धीरे मेजबान कोशिकाओं के monolayer ऊपर मध्यम aspirate। monolayer परेशान करने से बचने, के रूप में यह नमूना नुकसान हो सकता है।
- 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार कुल्ला।
- धीरे पीबीएस aspirate। तुरंत वांछित प्रोटीन एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए ठंडा lysis बफर का एक उचित मात्रा लागू होते हैं, और सेते15 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने हैं। 200 μl और प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से lysis बफर के 350 μl के बीच लागू 0.5 और 1.5 मिलीग्राम / एमएल के बीच प्रोटीन सांद्रता को प्राप्त करने के लिए।
नोट: सेल इन अध्ययनों में प्रयुक्त बफर विआयनीकृत पानी से बना था, 1% (वी / वी) Nonidet P40 विकल्प नहीं है, एक फॉस्फेट अवरोध कॉकटेल, और एक protease अवरोध कॉकटेल। विशिष्ट अभिकर्मकों सामग्री और उपकरण खंड में सूचीबद्ध हैं। - अच्छी तरह से प्रत्येक की थाली की सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग करें और अच्छी तरह से एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक की संपूर्ण सामग्री पिपेट।
- 4 सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र नमूने हैं।
- घुलनशील lysate घटकों का आकलन करने के लिए, -20 सेल्सियस पर एक ताजा ट्यूब और स्टोर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला हटाने या तुरंत का उपयोग करें।
- परमाणु या अन्य अघुलनशील lysate घटकों का आकलन करने के लिए, -20 सेल्सियस पर गोली और दुकान आरक्षित या तुरंत का उपयोग करें।
- जैसासमुद्री डाकू मध्यम और 1x ठंड पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें।
- पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के घोल में रात भर कोशिकाओं को ठीक (डब्ल्यू / वी)।
नोट: इन अध्ययनों में, पीएफए के 1 मिलीलीटर प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से जोड़ा गया है।
5. सुझाव अनुप्रयोगों
- संकेत पारगमन विश्लेषण मेजबान एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता द्वारा
- धारा 4.3 में वर्णित के रूप में मेजबान सेल lysates लीजिए।
- Bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख या बराबर प्रोटीन मानकों का प्रयोग 30 से प्रत्येक नमूना lysate के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
- नमूने के बीच प्रोटीन सांद्रता को सामान्य लोड करने से पहले और एक 4-15% polyacrylamide जेल या उपयुक्त विकल्प 31 पर नमूने चल रहा है।
- नमूना मात्रा - एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक नमूना (जैसे 20 माइक्रोग्राम) से एक ही प्रोटीन राशि pipetting और बफर मात्रा lysis बफर के चर मात्रा में (= कुल मात्रा जोड़कर नमूना सांद्रता को सामान्यजोड़ा) प्रत्येक ट्यूब कुल मात्रा (जैसे 50 μl) और नमूने भर में अंतिम प्रोटीन एकाग्रता बराबर बनाने के लिए।
- एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली (या समतुल्य) के लिए स्थानांतरण नमूने हैं। यहाँ वर्णित परिणामों के लिए, एक अतिरिक्त 45 मिनट के लिए 70 वोल्ट के वोल्टेज में वृद्धि से पहले 2 घंटे के लिए 25 वोल्ट पर नमूने हस्तांतरण। 200 मिमी Tris आधार, 1.5 एम ग्लाइसिन और 20% मेथनॉल (वी / वी) विआयनीकृत पानी में से बना स्थानांतरण बफर का प्रयोग करें।
- 5% Tris में बीएसए + 0.1% बीच 20 में ब्लॉक झिल्ली खारा (टीबीएस) बफर। समायोजित तदनुसार निर्माता सिफारिशों के आधार पर लिए एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जाएगा।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं। निर्माता पर उपयोग के कमजोर पड़ने की सिफारिश की।
- टीबीएस + 0.1% बीच 20 में 1.5 घंटे के लिए झिल्ली धो; हर 10-15 मिनट बफर ताज़ा करें।
- हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के साथ सेते हैं 1 के कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित: 5,000 कमरे temperat पर 1.5 घंटे के लिएUre।
- टीबीएस + 0.1% बीच 20 में 1.5 घंटे के लिए झिल्ली धो; 15 मिनट - हर 10 बफर ताज़ा करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार फिल्म पर विकसित करने से पहले chemiluminescence पता लगाने अभिकर्मक के साथ झिल्ली सेते हैं। अन्य तरीकों का पता लगाने के रूप में वांछित इस्तेमाल किया जा सकता है।
- मेजबान कोशिका इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और इमेजिंग
- धारा 4.4 में वर्णित के रूप में मेजबान कोशिकाओं से युक्त coverslips को ठीक करें।
- पीएफए समाधान निकालें और पीबीएस में इलाज किया कोशिकाओं दो बार युक्त coverslips धोने, washes के बीच श्वास।
नोट: पीएफए बेहद जहरीला है और उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए। - 1% के साथ पीबीएस में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए coverslips ब्लॉक (w / v) सामान्य बकरी सीरम, 2% (वी / वी) ट्राइटन X-100, और 0.5% (वी / वी) बीच 20।
- coverslips बफर हर 10 मिनट ताज़ा, 30 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धो लें।
- एक 1:50 के अनुपात में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ coverslips सेते हैं (या के रूप में निर्माता द्वारा अनुशंसित) प रोकने मेंसंविधान रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- ताज़ा हर 30 मिनट बफर, पीबीएस में 1.5 घंटे के लिए coverslips धो लें।
- माध्यमिक एंटीबॉडी में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं coverslips (बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी AlexaFluor488 इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया था) एक 1 का उपयोग: समाधान को रोकने के लिए एंटीबॉडी के 200 अनुपात।
- धो 1 घंटे के लिए coverslips, बफर हर 20 मिनट ताज़ा।
- वांछित दाग को लागू करें।
नोट: इन अध्ययनों से उपयोग किया DAPI (परमाणु दाग) और 1 के अनुपात में rhodamine-phalloidin (actin दाग): समाधान को रोकने में 1,000। - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए परमाणु और actin दाग के साथ coverslips सेते हैं।
- coverslips हर 10 मिनट बफर ताज़ा, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में धो लें।
- बढ़ते माध्यम का उपयोग कर गिलास स्लाइड पर coverslips माउंट।
- coverslips सील और इमेजिंग के लिए रात भर पहले की स्लाइड्स पर स्थापित करने के लिए अनुमति दें। यहाँ वर्णित परिणामों के लिए, एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी यूएसआई पर छवियों को इकट्ठाएक मानक 20X उद्देश्य एनजी। कब्जा कर लिया छवियों को संसाधित करने के ImageJ और माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
- Ethidium homodimer सेल मौत परख
- प्रत्येक अच्छी तरह से और बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने से महाप्राण मध्यम।
- पीबीएस में लागू करें 4 माइक्रोन के ethidium homodimer -1।
- अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को सेते हैं।
- एक प्लेट रीडर 528 एनएम उत्तेजना और 590 एनएम के एक कटऑफ मूल्य के साथ 617 एनएम उत्सर्जन करने के लिए सेट का उपयोग कर प्रतिदीप्ति के स्तर को निर्धारित करते हैं।
- 0.1% (w / v) Saponin प्रत्येक अच्छी तरह से निम्नलिखित प्रारंभिक पढ़ने में जोड़ें और प्लेट प्लेट एक ही सेटिंग में एक दूसरी बार पढ़ने से पहले कमरे के तापमान (कमाल के साथ) पर एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए सेते दें।
- पढ़ने (पोस्ट-Saponin) दूसरे प्रतिदीप्ति द्वारा प्रारंभिक प्रतिदीप्ति पढ़ने (बाद इलाज) विभाजित करके अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए व्यक्तिगत रूप का निर्धारण करते प्रतिशत झिल्ली permeabilization।
- एटीपी निर्धारण परख
- बीसीए परख या इसी तरह 30 के माध्यम से lysates में प्रोटीन का स्तर सामान्य।
- एक luminescence आधारित एटीपी दृढ़ संकल्प किट या निर्माता के निर्देशों के अनुसार बराबर का उपयोग सेलुलर एटीपी के स्तर का निर्धारण करते हैं।
- इसी असंक्रमित नियंत्रण नमूने के लिए इलाज मूल्यों मानक के अनुसार।
- LDH रिलीज परख
- संक्रमण के बाद, supernatants धारा 4.3 में वर्णित के रूप में इकट्ठा।
- LDH रिलीज मूल्यांकन निर्माता के निर्देशों के अनुसार LDH रिहाई के लिए एक cytotoxicity का पता लगाने किट का उपयोग।
Representative Results
पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली secreted बैक्टीरियल कारकों के अध्ययन के लिए विकसित प्रोटोकॉल चित्रा 1. इस प्रणाली बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं की जुदाई पर निर्भर करता है एक झरझरा झिल्ली के माध्यम से secreted बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए विस्तृत है, इस मामले में Streptolysin एस (एसएलएस), इस तरह मेजबान झिल्ली अखंडता, सेलुलर व्यवहार्यता, सेलुलर संकेत पारगमन, और secreted मेजबान सेल कारकों के रूप में मेजबान प्रतिक्रियाओं पर। चित्रा 2 प्रदर्शन है कि इस प्रणाली से संपर्क के सक्रियण में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रतिनिधि वेस्टर्न ब्लाट डेटा प्रदान करता है स्वतंत्र मेजबान संकेत प्रोटीन। विशेष रूप से, प्रतिनिधि डेटा काफी एसएलएस उत्पादक गैस उपभेदों की उपस्थिति में p38 MAPK सक्रियण बढ़ाया दिखा। इस प्रणाली को भी immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मेजबान प्रोटीन स्थानीयकरण पर स्रावित बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव (कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है <strong> चित्रा 3)। डेटा एसएलएस निर्भर कुंजी भड़काऊ मध्यस्थ परमाणु कारक कापा बी (NFκB), जो सक्रियण 21 पर नाभिक के लिए कोशिका द्रव्य से translocates की सक्रियता का दिखा। आंकड़े 2 और 3 में परिणाम से संकेत मिलता है कि दोनों SLS-निर्भर भड़काऊ सिगनल प्रतिक्रियाओं बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच सीधे संपर्क की आवश्यकता नहीं है। पिछले प्रयोगों को पहले से ही प्रदर्शन किया है के रूप में एसएलएस निर्भर p38 और प्रत्यक्ष संक्रमण मॉडल 21, p38 या पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली में तीन गैस उपभेदों के बीच NFκB सक्रियण के समान स्तर में NFκB सक्रियण संकेत दिया है | प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है कि दोनों के बीच सीधा संपर्क बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं। चित्रा 4 दर्शाता है कि इस संक्रमण प्रणाली ethidium homodimer और LDH रिलीज assays के माध्यम से मेजबान cytotoxicity में विष-निर्भर परिवर्तन का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह उल्लेखनीय वृद्धि मैं इसका सबूत हैn दोनों झिल्ली permeabilization और गैस असंक्रमित कोशिकाओं या कोशिकाओं एसएलएस की कमी तनाव को उजागर कर की तुलना में एसएलएस युक्त उपभेदों के संपर्क में मेजबान कोशिकाओं से LDH की रिहाई में। के रूप में महत्वपूर्ण प्रभाव जब तक झिल्ली permeabilization के मामले में 12 घंटे के बाद संक्रमण और LDH रिहाई के मामले में 16 घंटा स्पष्ट नहीं कर रहे cytotoxicity में ये परिवर्तन, तत्काल नहीं हैं। प्रतिनिधि डेटा इन मेजबान प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए उचित समय अंक और संक्रमण की स्थिति के चयन के महत्व को दर्शाते हैं। (चित्रा 5) मेजबान संकेत परिवर्तन और cytotoxicity के आकलन के लिए अनुमति देता है के अलावा, पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली मेजबान सेल lysates के जीवाणु संक्रमण को रोकने के द्वारा इस तरह मेजबान एटीपी के स्तर का सही निर्धारण के रूप में चयापचय परिवर्तनों के अध्ययन के लिए लागू होता है । ये आंकड़े 16 घंटे से गैस संक्रमण के जवाब में keratinocyte एटीपी की एक महत्वपूर्ण नुकसान दिखाने बढ़ाया एटीपी हानि के साथ संक्रमण के बाद, मैंn एसएलएस की उपस्थिति। इन परिणामों के मेजबान तनाव प्रतिक्रिया संकेतन और cytotoxicity में मनाया विष-निर्भर वृद्धि के साथ संगत कर रहे हैं।
चित्रा 1: पारगम्य झिल्ली का आरेख सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली प्रोटोकॉल मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए मानव keratinocytes नीचे डिब्बे में चढ़ाया और 90% संगम हो जाता है।। 0.4 माइक्रोन pores के साथ एक कोलेजन लेपित झिल्ली ऊपरी और निचले कक्षों को अलग करती है, और बैक्टीरिया के संक्रमण वांछित अवधि के लिए पारगम्य झिल्ली डालने प्रणाली के ऊपरी सदन के लिए जोड़ रहे हैं। सेल संस्कृति supernatants और मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण अवधि के बाद एकत्र किया जा सकता है और विश्लेषण की एक किस्म के लिए उपयोग किया। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की।
चित्रा 2:। पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता द्वारा होस्ट सेल lysate विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता प्रतिनिधि डेटा कि एसएलएस संक्रमित केरेटिनकोशिकाओं में p38 MAPK मार्ग की सक्रियता को बढ़ाता प्रदर्शित करता है। (ए) HaCaTs गैस के साथ 7 घंटे के लिए पारगम्य झिल्ली डालने संक्रमण प्रणाली के माध्यम से संक्रमित थे (MOI = कम 10) और lysates p38 की सक्रियता के लिए मूल्यांकन किया गया। (बी) के तीन स्वतंत्र पश्चिमी blots से डेन्टिसिटोमीटरी GAS'infection के जवाब में p38 के रिश्तेदार सक्रियण यों करने के लिए किया गया था। तीन जैविक प्रतिकृति से मूविंग मानक विचलन का प्रतिनिधित्व त्रुटि सलाखों के साथ दिखाया गया है। p38 के सापेक्ष सक्रियण फॉस्फोरिलेटेड / कुल प्रोटीन के स्तर के रूप में प्रतिनिधित्व किया है। सांख्यिकीय महत्व की तुलना में निर्धारित किया गया थाअसंक्रमित कोशिकाओं। कुल मिलाकर पी मूल्य एनोवा (पी = 0.0063) द्वारा निर्धारित किया गया था। Dunnett का परीक्षण इसी असंक्रमित नियंत्रण करने के लिए हर हालत की तुलना करने का मतलब यह पोस्ट अस्थायी प्रदर्शन किया गया। *, पी = 0.01-0.05; **, पी = 0.001-.01; ***, पी = 0.0001-0.001; ****, पी <0.0001। यह आंकड़ा से Flaherty एट अल। 2015 21 संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा होस्ट संकेतन परिवर्तन के दृश्य के लिए अनुमति देता है कि प्रतिनिधि डेटा Streptolysin एस NFκB के सक्रियण के माध्यम बढ़ाता समर्थक भड़काऊ सिगनल दिखा। HaCaT मानव keratinocytes एक एम पर गैस से संक्रमित थे 8 घंटे के लिए 10 के ओपन इंटरेस्ट पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली का उपयोग कर। (ए और बी) NFκB के परमाणु स्थानीयकरण immunofluorescence इमेजिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था। परमाणु स्थानीय कोशिकाओं का प्रतिशत जो कोशिकाओं में NFκB एक दिए गए क्षेत्र के लिए नाभिक cytoplasm से translocated था की संख्या की गणना और एक ही क्षेत्र के लिए कोशिकाओं की कुल संख्या से उस नंबर को विभाजित करके गणना की गई। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। (ए) तीन जैविक प्रतिकृति की औसत मानक विचलन का प्रतिनिधित्व त्रुटि सलाखों के साथ हर हालत के लिए प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। कुल मिलाकर पी मूल्य एनोवा द्वारा निर्धारित किया गया था; पी <0.0001। Dunnett का परीक्षण इसी असंक्रमित नियंत्रण हालत के लिए हर हालत तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया। *, पी = 0.01-0.05; **, पी = 0.001-.01; ***, पी = 0.0001-0.001; ****, पी <0.0001। यह आंकड़ा Flaherty एट अल। 2015 21 से संशोधित किया गया है।/ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच सीधे संपर्क के अभाव में बैक्टीरियल की मध्यस्थता झिल्ली permeabilization और cytotoxicity के निर्धारण के लिए अनुमति देता है कि प्रतिनिधि डेटा keratinocyte व्यवहार्यता सक्रिय एसएलएस विष की उपस्थिति में कम हो जाती है प्रदर्शित । गैस - प्रेरित कोशिका मृत्यु गुम्मट की उपस्थिति में HaCaT कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया था, एसएलएस की कमी या गाथा गैस पूरित केरेटिनकोशिकाएं से 10 के MOI (कम 8-16 घंटे के लिए पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली का उपयोग गैस के संपर्क में थे। ए) व्यवहार्यता ethidium homodimer परख या (बी) LDH रिलीज परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था। दोनों पैनलों में, 3 पुनplicates औसत रहे हैं और त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते। हर समय बिंदु के लिए महत्व एनोवा (ए) 8 घंटा, पी = 0.0241 द्वारा निर्धारित किया गया था; 12 घंटा, पी <0.0001 (बी) 8 घंटा, पी = 0.0287; 12 घंटा, पी = 0.1977; 16 घंटा, पी = 0.0031। Dunnett का परीक्षण इसी समय बिंदु के लिए जंगली प्रकार के संक्रमण के लिए हर हालत से साधन तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया। *, पी = 0.01-0.05; **, पी = 0.001-.01; ***, पी = 0.0001-0.001; ****, पी <0.0001। यह आंकड़ा से Flaherty एट अल। 2015 21 संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली Bact को रोकने के द्वारा होस्ट एटीपी के स्तर का सही निर्धारण के लिए अनुमति देता हैमेजबान कोशिका की erial संदूषण lysates। प्रतिनिधि डेटा एसएलएस निर्भर ग्रुप ए streptococcal संक्रमण के दौरान एटीपी की हानि प्रदर्शित करता है। HaCaT कोशिकाओं पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली का उपयोग 8-16 घंटे के लिए गैस के साथ संक्रमित थे। तकनीकी प्रतिकृति (एन = 3) एक प्रतिनिधि जैविक को दोहराने (नमूना प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं), हर हालत के लिए औसतन थे मानक विचलन का प्रतिनिधित्व त्रुटि सलाखों के साथ से। कुल मिलाकर पी मूल्यों एनोवा द्वारा निर्धारित किया गया है (12 घंटा, पी <0.0001, 16 घंटा, पी <0.0001)। Dunnett का परीक्षण इसी समय बिंदु के लिए जंगली प्रकार के संक्रमण के साथ हर हालत तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया। *, पी = 0.01-0.05; **, पी = 0.001-.01; ***, पी = 0.0001-0.001; ****, पी <0.0001। यह आंकड़ा से Flaherty एट अल। 2015 21 संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
इस के साथ साथ एक विधि बैक्टीरियल विष इन विट्रो प्रणाली में मानव उपकला केरेटिनकोशिकाओं पर Streptolysin एस के प्रभाव की जांच करने के लिए एक पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली का उपयोग वर्णित है। इस प्रोटोकॉल अन्य secreted बैक्टीरियल विषैलापन कारकों के अध्ययन के साथ ही वैकल्पिक मेजबान सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 3,8,18 - - 20 यह हाल ही में विकसित प्रणाली प्रयोगात्मक विधियों कि शुद्ध विषाक्त पदार्थों या फ़िल्टर बैक्टीरियल supernatants 1 उपयोग पर कई लाभ प्रदान करता है। पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली के रूप में यह उत्पादन किया जाता है कोशिकाओं की मेजबानी के लिए प्रासंगिक बैक्टीरियल विष है, जो अधिक से अधिक विष गतिविधि को बनाए रखा जा करने की अनुमति देता है एक लगातार बनाए रखा खुराक प्रदान करता है और यह भी प्रयोगों के बीच स्थिरता बढ़ जाती है। साथ ही, इस प्रणाली को और अधिक बारीकी से स्रावित कारक समय पर जमा के रूप में संक्रमण की प्रगति की अनुमति देकर और elimi द्वारा शारीरिक शर्तों mimicsमनमाने ढंग से विशिष्ट विष सांद्रता का चयन करने की जरूरत nating कोशिकाओं की मेजबानी के लिए लागू करने के लिए। इसके अलावा, इस प्रणाली को भी जांचकर्ताओं का आकलन करने के लिए ब्याज की एक जीवाणु कारक संपर्क निर्भर तरीके में कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए दिया जाता है कि क्या साधन प्रदान करेगा। संपर्क-निर्भरता अक्सर isogenic जीवाणु पालन में या अभिकर्मकों कि पालन को रोकने के उपयोग के माध्यम कमी म्यूटेंट की पीढ़ी के माध्यम से परीक्षण किया है। यहाँ वर्णित प्रणाली के पूरक हैं या इन पारंपरिक तरीकों को बदलने के लिए एक सरल विकल्प प्रदान करेगा।
प्रोटोकॉल की धारा 5 में वर्णित परीक्षण किया अनुप्रयोगों के अलावा, अन्य अनुप्रयोगों जो इस संक्रमण प्रणाली को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता साइटोकाइन सरणियों और एलिसा assays के लिए नमूनों के संग्रह में शामिल करने के लिए। इन दोनों मामलों में, LDH रिलीज assays के लिए वर्णित है कि एक समान प्रोटोकॉल का पालन किया जा सकता है। हालांकि यहां नहीं दिखाया गया है, इस प्रणाली को प्रभावी ढंग से एक होने के लिए मेजबान सेल के नमूने एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैप्रवाह cytometry द्वारा nalyzed। इस आवेदन में, पारगम्य झिल्ली डालने संक्रमण अवधि के बाद हटा दिया जाता है, कोशिकाओं सेल संस्कृति के माध्यम से दूर करने के लिए धो रहे हैं, और trypsin विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के संग्रह की अनुमति के लिए आवेदन किया है। क्योंकि यह बड़ी पालन बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं है कि अन्यथा प्रवाह से सटीक सेल गिनती के साथ हस्तक्षेप कर सकता है के शामिल समुच्चय के गठन को रोकने में मदद करता है मेजबान कोशिकाओं से बैक्टीरिया के भौतिक जुदाई इस आवेदन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
हालांकि बहुत संगत मेजबान प्रतिक्रियाओं जब पारंपरिक प्रत्यक्ष संक्रमण पढ़ाई के साथ पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण अध्ययन के परिणामों की तुलना देखा गया है, इन मेजबान प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स में कुछ उल्लेखनीय मतभेद 21 मनाया गया है। उदाहरण के लिए, मेजबान संकेतन और झिल्ली आधारित cytotoxicity में परिवर्तन भ्रष्टाचार से पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण मॉडल में घटित करने के लिए लंबे समय तक 30-50% लेप्रत्यक्ष संक्रमण मॉडल जवाब। क्योंकि पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली प्रत्येक के ऊपरी और निचले डिब्बों में अच्छी तरह से करने के लिए लागू किया जा करने के लिए माध्यम की आवश्यकता है, यहाँ वर्णित प्रणाली के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से विकसित की तुलना में प्रति इसी पहले से इस्तेमाल प्रत्यक्ष संक्रमण मॉडल के लिए कुल मध्यम मात्रा में एक 30% वृद्धि की आवश्यकता 21। कुल मध्यम मात्रा में यह अंतर, बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच वृद्धि की दूरी के साथ मिलकर जब सीधे संपर्क निषिद्ध है, संभावना समय एसएलएस मेजबान कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए माध्यम के माध्यम से फैलाना और मनाया प्रभाव प्रकाश में लाना करने के लिए इसे लेता है बढ़ जाती है। इसके अतिरिक्त, पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली कई गैस विषैलापन कारक है कि कोशिका क्षति की मेजबानी के लिए योगदान करने की संभावना है निकालता है; इस प्रणाली में इन अतिरिक्त कारकों के अभाव भी मेजबान कोशिका मृत्यु और प्रत्यक्ष संक्रमण 21 की तुलना में मेजबान संकेत घटनाओं की दीक्षा में देरी के लिए योगदान करने की संभावना है। इन कारकों पर विचार किया जाना चाहिएजब प्रयोगों डिजाइनिंग अन्य secreted बैक्टीरियल घटकों का आकलन करने के लिए।
, मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल कारकों के प्रभाव का परीक्षण पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण प्रणाली के प्रत्येक आवेदन के लिए समय अंक की एक श्रृंखला के परीक्षण की सिफारिश की है के लिए सबसे सार्थक स्थितियों की पहचान करने के लिए। यह क्या शर्तों के हित के विशिष्ट विषैलापन कारक बेहतर (जैसे लॉग चरण, स्थिर चरण, कुछ पर्यावरण संकेतों के जवाब में, आदि) का उत्पादन किया है क्रम में सफलतापूर्वक अपने प्रभाव का पालन करने के तहत विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। मेजबान संकेत प्रोटीन में परिवर्तन के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित प्रयोगों में, यह समय बताते हैं कि पर्याप्त समय एसएलएस मेजबान कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए और संकेतन बदलता 21 प्रेरित करने के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पादन किया जा करने के लिए अनुमति का चयन करने के लिए आवश्यक था। इसी समय, मेजबान संकेत की जरूरत में परिवर्तन का आकलन, एसएलएस प्रेरित झिल्ली permeabilization से पहले ही किया जा सकता इस आशय सी के रूप मेंविश्लेषण के लिए मेजबान सेल lysates के संग्रह omplicates। कोशिका मृत्यु एसएलएस से प्रेरित बेहतर सूचना दी संकेत घटनाओं में 21 की दीक्षा के बाद कई घंटे दोनों को प्रत्यक्ष और पारगम्य झिल्ली डालने आधारित संक्रमण मॉडल में मनाया जा सकता है। इसके अलावा, ब्याज की समय अंक के चयन में, यह भी महत्वपूर्ण है कि यह सुनिश्चित करने बैक्टीरिया अध्ययन किया जा रहा अध्ययन की अवधि के दौरान झरझरा डालने झिल्ली घुसना करने में असमर्थ हैं। एक विस्तारित अवधि में कुछ जीवाणु घटकों के उत्पादन झिल्ली की अखंडता को बाधित और कम डिब्बे के लिए बैक्टीरिया के पारित होने की अनुमति हो सकती है। क्या यह ब्याज की प्रणाली में एक संभावित समस्या है निर्धारित करने के लिए, जीवाणु उपभेदों अध्ययन किया जाना समय अंक की एक श्रृंखला में पारगम्य झिल्ली डालने आधारित प्रणाली के ऊपरी सदन के लिए लागू किया जा सकता है। हर समय बिंदु पर, सम्मिलित ध्यान से हटाया जा सकता है और नीचे कक्ष से मध्यम एकत्र की है और एक मानक कॉलोनी सह में उपयोग किया जा सकताunting परख (खंड 1.5 देखें)। कोई कालोनियों कम डिब्बे में सेल संस्कृति के माध्यम से बनते हैं, तो डालने झिल्ली को प्रभावी ढंग से समय बिंदु और बैक्टीरियल लोड परीक्षण किया पर बैक्टीरिया के पारित होने को रोकने माना जा सकता है।
एक और प्रयोगात्मक डिजाइन घटक है कि स्रावित बैक्टीरियल कारकों के प्रभावी विश्लेषण के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होने की संभावना है संक्रमण (MOI) की बहुलता है। MOI मेजबान सेल प्रति बैक्टीरियल कोशिकाओं के अनुपात को संदर्भित करता है, और इसलिए संक्रमण के समय में और बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या (CFU) द्वारा मेजबान सेल confluency से प्रभावित है कोशिकाओं के लिए आवेदन किया। इन अध्ययनों में, keratinocyte कोशिकाओं 90% confluency, जो इन कोशिकाओं को बरकरार तंग जंक्शनों के साथ एक जोड़नेवाला monolayer फार्म करने की अनुमति के लिए बड़े हो रहे थे। मेजबान कोशिकाओं के शारीरिक संगठन के विचारशील विचार अध्ययन किया जा संक्रमण प्रयोगों के लिए एक उपयुक्त confluency का चयन करने के लिए आवश्यक है। एक बार एक approprमेजबान कोशिकाओं की देर हो गई संख्या प्रति अच्छी तरह से चुना गया है, एक उपयुक्त बैक्टीरियल CFU जा सकता गणना बंद वांछित MOI आधारित है। यहाँ वर्णित अध्ययनों में, गैस 10 उचित MOI के एक MOI में कोशिकाओं की मेजबानी के लिए अलग-अलग बैक्टीरिया के साथ और वांछित अनुवर्ती विश्लेषण के साथ अलग अलग होंगे लागू किया गया था। एक कम शुरुआत MOI आमतौर पर अधिक physiologically प्रासंगिक है और धीरे धीरे मेजबान सेल व्यवहार्यता में नाटकीय परिवर्तन से पहले मेजबान कोशिका संकेतन में सूक्ष्म परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त स्पष्ट कर रहे हैं जमा करने के लिए ब्याज की बैक्टीरियल कारक के लिए अनुमति देता है। उच्चतर MOIs cytotoxicity का आकलन कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन इस आशय भी एक कम MOI के साथ शुरुआत की है और संक्रमण के समय की एक लंबी अवधि के लिए प्रगति के लिए अनुमति देकर प्राप्त किया जा सकता है। यह ऑप्टिकल घनत्व परिणाम के लिए एक सटीक CFU का निर्धारण करने के लिए सभी जीवाणु उपभेदों परीक्षण किया जाना है, isogenic म्यूटेंट जंगली प्रकार के बैक्टीरिया की तुलना में एक बदल विकास दर हो सकती है के रूप में महत्वपूर्ण है और इसलिए है कि एक अधिक या कम CFU करने के लिए अच्छी तरह से प्रति जोड़ा जा आवश्यकता हो सकती हैप्रकारों के बीच मेजबान प्रतिक्रिया का एक उचित तुलना करता है। मामलों में जहां स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं का अध्ययन किया जा रहा है जीवाणुओं को मारने या उनके विकास में बाधा या यदि जीवाणु उपभेदों के बीच nonsynchronous विकास शक किया जाता है, यह भी संक्रमण की अवधि के अंत में अंतिम बैक्टीरियल लोड आकलन करने के लिए अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता करने में सक्षम हैं। इस पारगम्य डालने की सामग्री को इकट्ठा करने और एक कॉलोनी गिनती परख प्रक्रिया की धारा 1.5 में वर्णित है कि इसी तरह के प्रदर्शन से पूरा किया जा सकता है।
वांछित परख के लिए उचित आकार कुओं का चयन भी इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आकार के एक किस्म में उपलब्ध हैं, लेकिन यहाँ दिखाया अध्ययन के लिए सबसे अच्छी तरह से अनुरूप परिणाम 24 और 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के लिए डिज़ाइन किया गया आवेषण का उपयोग कर मनाया गया। ये डालने के आकार अपेक्षाकृत बाँझ संदंश के साथ संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, और हेरफेर की आसानी रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैअच्छी तरह से कम डिब्बे के लिए ऊपरी डिब्बे से बैक्टीरिया के अवांछित हस्तांतरण हैैं। मेजबान सेल lysates के संग्रह से जुड़े प्रयोगों के लिए, 6 अच्छी तरह से व्यंजन सबसे विश्लेषण के लिए शर्त के अनुसार एक उपयुक्त सेल नंबर प्रदान करते हैं और काफी बड़े नमूना संग्रह के लिए सेल स्क्रेपर्स समायोजित करने के लिए कर रहे हैं। Cytotoxicity assays जिसमें मेजबान कोशिकाओं पक्षपाती रहते हैं और एक फ्लोरोसेंट या colorometric डाई कि एक प्लेट रीडर पर मापा जा सकता है (जैसे ethidium homodimer परख, trypan नीले बहिष्कार परख) के साथ लेबल रहे हैं, इसी सम्मिलित करता है के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली का इस्तेमाल होता है की सिफारिश की। प्रयोगों में जो सेल संस्कृति के माध्यम से एकत्र की है और विश्लेषण किया जाएगा (जैसे LDH रिलीज, साइटोकाइन अध्ययन) के लिए या तो 24 में अच्छी तरह से या 6 अच्छी तरह प्लेटें, इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि छोटे कुओं आम तौर पर इन विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूना उपलब्ध कराने और आवश्यक का उपयोग कम से कम अभिकर्मकों। कुल मिलाकर, विधि बहुत बहुमुखी है और sampl तैयार करने की जरूरत अनुकूलित किया जा सकताकई अनुवर्ती अनुप्रयोगों के लिए तों।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
| Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
| HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
| 10 cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
| 6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| 24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
| Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
| Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
| Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
| Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
| Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
| Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
| Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ml | |
| Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
| LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
| Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
| DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
| Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
| Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |
References
- Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).
- Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314 (2011).
- Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970 (2012).
- Sumitomo, T., Nakata, M., et al. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).
- Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).
- Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).
- Stassen, M., Müller, C., et al. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).
- Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).
- Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).
- Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).
- Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).
- Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).
- Datta, V., Myskowski, S. M., et al. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).
- Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).
- Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).
- Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).
- Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).
- Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).
- Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).
- Gangl, K., Waltl, E. E., et al. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).
- Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).
- Zheng, Y., Guo, J., et al. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49 (2015).
- Losa, D., Köhler, T., et al. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).
- Cook, K. W., Letley, D. P., et al. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
