Le développement d'un anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer l'exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
L'étiologie et les impacts de l'exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux sont une préoccupation majeure dans le monde entier et, par conséquent, la capacité d'évaluer des approches à haut débit rentables d'exposition et les infections à l'aide serait indispensable. Ce mémoire décrit le développement et l'analyse d'un essai immunologique à base de billes multiplexe capable de mesurer la présence d'anticorps dans la salive humaine à des agents pathogènes multiples simultanément. Saliva est particulièrement intéressante dans cette application car elle est non invasive, moins cher et plus facile à recueillir que du sérum. Des antigènes provenant d'agents pathogènes environnementaux ont été couplés à des microsphères carboxylées (billes) et sont utilisés pour mesurer les anticorps dans de très petits volumes d'échantillons de salive humaine en utilisant un dosage en phase de solution à base de billes. Les billes ont été couplés à des antigènes provenant de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G et G I.1 II.4) et le virus de l' hépatite A. Faire en sorte que les antigènes sont suffisamment couplés àles billes, le couplage a été confirmée en utilisant des espèces, des anticorps de capture primaires dérivés d'animaux, suivie par une incubation avec biotinylés anti-espèce des anticorps de détection secondaires et de la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteur (SAPE). En tant que contrôle pour mesurer la liaison non spécifique, un jeu de billes a été traité de manière identique aux autres, sauf qu'il n'a pas été couplé à un antigène. Les billes d'antigène couplé et de contrôle ont ensuite été incubées avec des échantillons prospectivement recueillies salive humaine, mesurée sur un analyseur à haut débit basé sur les principes de la cytométrie de flux, et la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène a été mesurée dans médiane de fluorescence unités d'intensité (MFI) . Ce dosage immunologique multiplex a un certain nombre d'avantages, y compris davantage de données avec moins de l'échantillon; les coûts et la main-d'œuvre réduits; et la possibilité de personnaliser le test à plusieurs cibles d'intérêt. Les résultats indiquent que le dosage immunologique multiplex salivaire peut être capable d'identifier les expositions et les infections antérieures, qui peut être especially utile dans les études de surveillance impliquant de grandes populations humaines.
Introduction
Quatre-vingt-huit pour cent des maladies liées à la diarrhée dans le monde entier est associé à l' exposition humaine à l' eau contaminée, des aliments dangereux et un mauvais assainissement / hygiène, causant environ 1,5 millions de décès, dont la majorité sont des enfants 1. Ceci est une cause majeure de préoccupation pour les responsables de la santé publique et les décideurs politiques. Dans un effort pour enquêter sur les expositions et les maladies associées à l' origine hydrique et d' autres agents pathogènes environnementaux, nous avons développé un dosage immunologique multiplex pour mesurer les anticorps dans les échantillons humains 2-4. Cette méthode peut être appliquée à des études épidémiologiques pour déterminer l'exposition humaine à ces agents pathogènes et de mieux définir les infections de immunoprevalence et incidents.
Saliva est très prometteur comme alternative au sérum pour la recherche de biomarqueurs humains. Parmi les avantages de l' utilisation de la salive sont les non-invasivité et la facilité de prélèvement d'échantillons, à faible coût, et les échantillons peuvent être facilement recueillies auprès des enfants 5-7 </ Sup>. Des échantillons de sérum et de salive ont été largement étudiés pour les anticorps contre H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonie 12, hépatite virus A et C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, le virus de la dengue 16, le virus de l' immunodéficience humaine (VIH) 17 et Escherichia coli O157: H7 18.
Un dosage immunologique multiplex permet l'analyse de plusieurs analytes simultanément dans un volume d'échantillon unique et dans un seul cycle ou courir. Antigènes multiplexés de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, l' hépatite A virus, et deux norovirus ont été utilisés pour mesurer la salive humaine IgG et IgA 2-4 3,4 et plasma IgG 2,3 réponses d'anticorps à ces agents pathogènes en utilisant unà base de billes de dosage immunologique multiplexage. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec des études épidémiologiques de l'exposition aux microbes dans l'eau, le sol et la nourriture, le type de dosage décrit dans cette étude peut fournir des informations précieuses pour améliorer la compréhension des infections causées par des pathogènes environnementaux. En outre, les données d' anticorps salivaires obtenues à partir de ces études peuvent être utilisées pour améliorer les modèles d'évaluation des risques 19-22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces résultats indiquent que la méthode d'immuno-essai multiplex est utile pour établir une discrimination entre des échantillons de salive qui sont immunopositif ou immunonegative. Pour déterminer immunopositivité, un seul point de coupure a été développé par le calcul de la moyenne plus trois écarts-types des journaux transformé IMF réponses des perles découplées de contrôle testés avec tous les échantillons de salive. Le point de coupure a donné la capacité d'évaluer l'exposition et im…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
Riferimenti
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