Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l'esposizione umana ad agenti patogeni ambientali
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
L'eziologia e impatti di esposizione umana ad agenti patogeni ambientali sono di grande preoccupazione in tutto il mondo e, quindi, la capacità di valutare efficaci approcci high-throughput di esposizione e le infezioni utilizzando costo sarebbe indispensabile. Questo manoscritto descrive lo sviluppo e l'analisi di un immunodosaggio multiplex bead-based in grado di misurare la presenza di anticorpi nella saliva umana per diversi patogeni contemporaneamente. La saliva è particolarmente interessante in questa applicazione, perché è non invasiva, meno costoso e più facile da raccogliere dal siero. Gli antigeni da patogeni ambientali sono stati accoppiati a microsfere carbossilati (perle) e utilizzati per misurare gli anticorpi in molto piccoli volumi di campioni di saliva umana utilizzando una, saggio soluzione fasi bead-based. Beads sono stati accoppiati con gli antigeni di Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G e G I.1 II.4) e virus dell'epatite. Per garantire che gli antigeni sono stati sufficientemente accoppiatile perline, l'accoppiamento è stata confermata usando specie-specifici, anticorpi di cattura primario di derivazione animale, seguita da incubazione con biotinilati anti-specie anticorpi di rilevamento secondarie e streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE). Come controllo per misurare legame non specifico, un insieme di sferette è stata trattata in modo identico agli altri tranne che non è stato accoppiato a qualsiasi antigene. Le perle antigene-accoppiati e di controllo sono stati poi incubati con campioni di saliva umana prospetticamente raccolti, misurato su un analizzatore alto rendimento basato sui principi della citometria a flusso, e la presenza di anticorpi ciascun antigene è stata misurata in unità di intensità mediana fluorescenza (MFI) . Questo immunodosaggio multiplex ha una serie di vantaggi, tra cui più dati con meno di esempio; riduzione dei costi e del lavoro; e la possibilità di personalizzare il dosaggio per molti obiettivi di interesse. I risultati indicano che il test immuno-multiplex salivare può essere in grado di individuare esposizioni e infezioni precedenti, che può essere especially utile negli studi di sorveglianza che coinvolgono grandi popolazioni umane.
Introduction
L'ottantotto per cento delle malattie diarroiche in tutto il mondo è associata con l'esposizione umana ad acqua contaminata, alimenti non sicuri, e scarsa igiene / igiene, causando circa 1,5 milioni di morti, la maggior parte dei quali sono bambini 1. Questa è una delle principali cause di preoccupazione per i funzionari della sanità pubblica e dei responsabili politici. Nel tentativo di indagare le esposizioni e le malattie associate con vie d'acqua ed altri agenti patogeni ambientali, abbiamo sviluppato un test immunologico multiplex per misurare gli anticorpi in campioni umani 2-4. Questo metodo può essere applicato a studi epidemiologici per determinare l'esposizione umana a questi agenti patogeni e di definire meglio le infezioni immunoprevalence e incidenti.
La saliva contiene molto promettente come alternativa al siero per la ricerca biomarker umana. Tra i vantaggi derivanti dall'utilizzo di saliva sono la non invasività e facilità di raccolta del campione, a basso costo, ed i campioni possono essere facilmente raccolti da bambini 5-7 </ Sup>. I campioni di siero e saliva sono stati ampiamente studiati per gli anticorpi contro H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus dell'epatite A e C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus della dengue 16, virus dell'immunodeficienza umana (HIV) 17, ed Escherichia coli O157: H7 18.
Un immunodosaggio multiplex permette l'analisi di analiti multipli simultaneamente all'interno di un volume del campione singolo e all'interno di un singolo ciclo o correre. Antigeni multiplex da C. jejuni, T. gondii, H. pylori, sono stati utilizzati virus dell'epatite A, e due norovirus a misura umana salivare IgG 2-4 e IgA 3,4 e nel plasma IgG 2,3 risposte anticorpali a questi agenti patogeni con unbead-based immunologico multiplexing. Quando utilizzato in combinazione con studi epidemiologici di esposizione ai microbi in acqua, suolo e cibo, il tipo di analisi descritto in questo studio può fornire informazioni preziose per migliorare la comprensione delle infezioni causate da patogeni ambientali. Inoltre, i dati di anticorpi salivari ottenuti da tali studi possono essere utilizzati per migliorare i modelli di valutazione del rischio 19-22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questi risultati indicano che il metodo immunologico multiplex è utile per discriminare tra campioni di saliva che sono immunopositive o immunonegative. Per determinare immunopositività, un unico punto di cut-off è stato sviluppato calcolando la media più tre deviazioni standard dei log trasformato risposte MFI del controllo perline disaccoppiati testati con tutti i campioni di saliva. Il punto di cut-off concessa la possibilità di valutare l'esposizione e immunoprevalence ad un singolo o più agenti patogeni. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
Riferimenti
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