신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 세 가지 신경 계통으로 분화 할 수 세포를 참조하십시오. 여기서는 클론 조건 neurosphere 형성 및 분화를 이용하여 주어진 세포 집단에서 NSC 주파수를 결정하는 프로토콜을 기술한다.
성상 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포 – 신경 줄기 세포 (NSCs을)를 갱신 자신과 세 가지 주요 신경 계통을 생성 할 수있는 기능이 있습니다. NSCs의 신경 전구 세포 (NPS는) neurosphere를 같은 시험관 내에서 일반적으로 배양한다. 이 프로토콜은 클론 조건 하에서 주어진 세포 인구의 NSC 주파수를 결정하는 방법을 자세히 설명합니다. 프로토콜은 neurosphere를 클론의 생성을 허용하는 농도로 세포의 파종 시작된다. neurosphere를 다음 챔버 커버 슬립에 전송하고 neurosphere를의 분화 잠재력을 극대화 컨디셔닝 매체에서 클론 조건에서 차별화된다. 마지막으로, NSC 주파수 neurosphere 능성 형성 및 기능에 기초하여 계산된다. 이 프로토콜의 유틸리티 후보 NSC 마커의 평가, NSCs을 정화하고, NP에에서 NSCs을 구별 할 수있는 능력을 포함한다. 이 방법은 다량의 인 수행 십삼일 얻어현재의 방법보다 horter는 NSC 주파수를 열거합니다.
신경줄 기세포 (NSCs의)은 자기 갱신 및 능성 수있는 중추 신경계 (CNS)의 셀이다. NSCs을 먼저 배아 전뇌의 개발 기간 동안 지정된 및 측면 심실의 뇌실 영역 (SVZ)와 해마의 치아 이랑 (DG)으로 특정 지역에서 성인 뇌에 계속 계속된다. NSC 라인들의 개수는 배튼 병 (1)과 같은 행정 및 다른 신경 질환의 치료를위한 임상에 사용되고있다.
NSCs의 신경 전구 세포 (NPS는) neurosphere를 호출 3 차원 회전 타원체 구조를 부동으로 문화에 전파됩니다. 이들은 배아 및 성체 피질 세포는 표피 성장 인자 (EGF)와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 2-4의 존재 나눌 수 있다는 것을 발견했을 neurosphere 배양 시스템은 1990 년대 초 레이놀즈와 바이스에 의해 개발되었다. neurosphere를은 C의 이종 혼합 구성다른 발달 단계 5에서 서브 클래스의 포함 ELL 학생. 이 때문에 구체적으로 된 NP의 존재 neurosphere를 얻은 데이터를 이용 NSCs의 공부 도전. 그러므로, neurosphere를으로부터 NSCs의 농축 중요하다. 현재, 네 가지 방법은 시험 관내 NSCs을 위해 농축하는데 사용되어왔다. 먼저 세포 표면 마커의 사용이다. 루이스-X (LEX)와 (도 Prominin1라고도 함) CD133은 NSC가 6-9 마커 가장 눈에 띄는 세포 표면입니다. Syndecan-1, 노치-1과 인테그린-β1은 NSCs의 10 풍요롭게 다른 표면 단백질이다. 두 번째 염료 제외입니다. 형광 DNA 결합 훽스트 33342 염색을 펌프에 고유 한 능력을 가지고 사이드 인구 셀, 11 NSCs의 농축되는 것으로 나타났다. 셋째 형태 선택의 사용이다. 증가 셀 크기와 입도와 세포가 자신의 대응 5,12,13보다 더 NSCs의 항구 것을 증명하고있다. 넷째 NSC 스와의 추가이다문화 매체에 rvival 요인. 그것은 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸의 추가를 보였다과 아포 지단백 E는 NSC의 생존을 향상시키고, 따라서 NSC 주파수 14, 15을 증가시킨다. 전사 인자를 포함하여 많은 마커 NSCs의 16, 17과 연관되어 있지만, 이러한 마커 중 어느 것도 순도에 NSCs을 농축 할 수 없습니다. 최종 NSC 마커의 부족으로 인해, 그것은 NSCs의 정량화 및 시험 관내에서 NP에 구별 할 과제로 남아.
초기 연구는 NSCs의 7,11,13을 정량화하기 위해 neurosphere 형성 분석 (NFA)를 사용했다. 이 분석에서, 세포를 해리 neurosphere를 형성하는 배양하고 neurosphere를 수가 결정된다 도금 매 100 세포 생성. 이 값은 Neurosphere 형성 장치 (NFU)로 불린다. 모든 neurosphere를가 NSCs을에서 발생하는 경우 NFU는 NSC 주파수를 동일합니다. 그러나, neurosphere를 양쪽 NS에 의해 형성되는 것과 NFU은 NSC 주파수 과대 평가 것으로 나타났다CS 초 NP에 5. 따라서, 전적으로 neurosphere 형성에 따라 NSCs의를 열거 할 수 정확합니다. 그것은 그들의 능력에 따라 NSCs을 정량화 할 수있을 수있다, 자기 갱신 광범위하게 확산 및 능성 neurosphere를를 생성합니다.
응답 EGF와 bFGF에있는 NSCs의는 일반적으로 최소 10 구절 생존 따라서 문화 4,18-20 광범위한 자기 갱신 용량을 표시합니다. 물론 반응 EGF 및 bFGF를이다 NPS는, 또한 장시간 몇 통로 아니지만위한 neurosphere를 생성 할 수있다. 따라서, 널리 선의 NSCs의 적어도 열 통로 용 neurosphere 형성에 기초한 공정 정밀도로 열거 할 수 있다고 인정되어왔다. 대부분의 연구에서, 그러나, 자기 갱신은 일반적으로 인한 열 통로에 필요한 장기 실험 시간에 2 차 또는 3 차 neurosphere 형성에 기초하여 측정된다. 이 때문에, NFA 차 광범위자가 재생산 능력 내기를 비교하는데 사용될 수있다싸우는 인구는하지만 정확하게 NSC 주파수를 열거 할 수 없습니다.
NSCs의은 NP에 비해 더 증식 능력을 가지고있다. NSCs을의이 속성은 루이 등의 알에 의해 사용되었다. 신경 식민지 형성 세포 분석 (NCFCA) 21, 22 – NSC 열거에 대한 분석을 개발. 이 분석에서, 단일 세포는 콜라겐 – 함유 매트릭스 반고체 3 주 동안 배양된다. 이러한 배양 조건에서, 그것은 직경이 2mm 이상 neurosphere를 형성 세포가 tripotent하고 장기적으로 자기 갱신 할 수 있습니다 것으로 나타났다. 이 세포들은 NSCs의로 정의됩니다. 따라서, NP는 NSCs을 효과적으로 구별된다.
NSCs의 성상은, 희소 돌기 아교 세포 및 신경 세포로 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. neurosphere를 분화를 들어, 성장 인자를 제거하고, 혈청 배양 배지에 첨가한다. 세 가지 신경 계통은 그 neurosphere을 시작한 후, 셀 neurosphere에서 관찰하는 경우 전NSC는이야. 그러나, 차별화 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 차별화에 사용 된 배양 조건은 세 가지 신경 계통의 생성을위한 최적되지 않을 수 있습니다. 사실, 단일 neurosphere 분화 과정에서 현저한 세포 사멸이 발생 주로 성상 세포 생성 (M 탐 및 미공개 아메드 S 등)를 발생한다. 둘째, clonality의 문제가 있습니다. NSCs의, neurosphere를 형성 및 분화의 정확한 계산을위한 각 neurosphere가 하나의 셀에서 발생 클론 조건 하에서 수행되어야한다. 벌크 현탁 배양에서 집계는 세포 및 neurosphere 수준 23-25 모두에서 발생한다. 각 neurosphere가 neurosphere 세고 능성의 평가를 복잡하게하거나 neurosphere를 여러 셀에서 발생하기 때문에, 그것이 가능하다. 최근의 증거는 세포의 집계는 0.5 세포 / 아래 μL 또는, 그리고 낮은 도금 밀도로 발생하지 않음을 보여줍니다 배양 플레이트는 NEU 동안 이동하지 않을 때rosphere 형성 15. 따라서 clonality을 보장 할 저밀도에서 세포를 배양.
현재는 NP에 NCFCA에서 NSCs의 구별 및 NSC 주파수를 열거 가장 널리 사용되는 방법이다. NCFCA 그러나 3 주 비교적 긴 시간을 필요로한다. 여기서는 능성 neurosphere를 형성하는 NSCs의 능력에 기초 NSC 주파수를 열거하는 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 수행하기 위해 단지 13 일이 소요됩니다. 콜라겐 매트릭스 neurosphere를 이동 방지 같이 NCFCA는 clonality을 보장한다. 이 프로토콜에서 사용되는 배양 조건은 clonality을 통하여 유지 될 수있다. 예를 들면, 50- 웰 챔버 커버 슬립의 사용은 neurosphere를 서로 접촉하지 않고 구별 할 것을 보장한다. 또한, 우리는 neurosphere를 (그림 1)의 분화 잠재력을 극대화하기 위해 차별화하는 동안 신경 영양 인자를 공급 매체 에어컨 사용합니다.
우리는 헤 클론 조건에서 NSCs을의 열거에 대해 설명합니다. 중요한 단계는 신선한 NSC 성장 및 분화 배지를 사용하고, 또한 도포에 갓 제조 PLL / 라미닌 용액의 사용 챔버 커버 슬립뿐만 아니라, 배양 접시를 포함한다. 이 neurosphere를 최적의 성장과 분화 조건을 보장합니다. 양질 항체의 사용은 효과적으로 신경 세포 및 아교 세포뿐만 아니라 다른 neurosphere를 접촉하지 않은 클론 neurosphere를 선택적 피킹을 검출하는, 중요하다. 또한, 건조하지 않는 촬상 neurosphere를 보장하는 것이 중요하다. 매 10 neurosphere를 따기 후 각 웰에 분화 매체의 10 μL를 추가하는 것이 좋습니다. 다른 샘플로부터 neurosphere를 사이에 크로스 토크를 피하기 위해 샘플 당 10cm 접시에 하나의 챔버가 커버 슬립을 사용하는 것이 중요하다. 두 커버 슬립 (다른 샘플에서 각각 neurosphere를 포함)을 배치하는 경우같은 10cm 접시, 하나의 coverslip에서 neurosphere를 특정 계통으로 분화하는 다른 커버 슬립에 neurosphere를의 성향을 바꿀 수있는 요소를 해제 할 수 있습니다. 같은 10cm 접시에 두 된 커버는 샘플 간의 믹스 업 될 수 있습니다.
NFU 또는 NSC 주파수가 예상보다 낮은 경우, 낮은 통로 번호 neurosphere를 사용되었는지 확인합니다. 건강 낮은 통로가 neurosphere를 조정 배지를 생성하기 위해 사용되는 것이 중요하다. neurosphere를은 96 웰 접시에 작은 지름을 가진 우물에서 배양하는 경우 다음에, 다음은 기동 및 마이크로 피펫을 사용하여 neurosphere를을 선택하기 어려울 것이다. 이 경우, 종래 따기 같은 6- 웰 접시 같은 큰 배양 접시에 neurosphere를 옮긴다. 촬상 neurosphere를 중 일부는 문화와 면역 염색 동안 챔버 커버 슬립으로부터 들어있다. 문화 동안 챔버 커버 슬립의 움직임, 덜 집중적 인 세척을 최소화면역 염색시 보내고, neurosphere를의 분리를 방지하기 위해 도움이 될 것이다.
초기 연구 만 NFA 7,11,13을 사용 NSCs의 정량화. NSCs의 초기 NP에 모두 neurosphere를 5로 생성하지만, NFA은 NSC 주파수 과대 평가. 루이스 등의 알은. NCFCA (21, 22)로 알려진 NSCs을 정량화하기 위해 다른 방법을 개발했다. NCFCA는 clonality 있도록 콜라겐 계 매트릭스 단일 세포를 배양하는 것을 포함하고, 직경 2mm 상기 neurosphere를 NSCs의 만에 의해 형성되는 것으로 나타났다. NCFCA 마찬가지로, clonality이 프로토콜을 통해 보장된다. 이는 클론 밀도 neurosphere를 생성하고 챔버 커버 슬립에 neurosphere를 차별화함으로써 달성된다. 챔버 커버 슬립의 사용은 많은 장점을 부여한다. 챔버 커버 슬립 각 샘플 neurosphere함으로써, 다른 샘플 neurosphere를 물리적 접촉을 갖는 분화 동안 clonality을 보장하지 않고 차별화 할 수 있습니다.챔버 커버 슬립은 샘플 neurosphere를 연속적으로 조절 될 최대 구별을 보장하기 위해 허용하는 분화 배지에 현탁 배치 될 수있다. 동안 분화 된 배지 및 혈청의 부재에서, neurosphere를 생존 감소하고 neurosphere를 주로 성상 세포 (탐 아메드 M 및 S, 미 출판)를 생성한다. 또한, 면역 염색 neurosphere를 편리하게 오랜 기간 동안 저장 될 수 있고, 챔버 커버 슬립 현미경 유리 슬라이드 상에 직접 장착 될 수있다. 한 빨리, 잘 챔버 작은에서 neurosphere를 찾아 이미지를 캡처하고, 다음 잘로 이동할 수 또한, 면역 염색 neurosphere를의 영상은 쉽게 이루어집니다.
우리는이 원고 (27)와 NCFCA (28)에 기술 된 프로토콜을 모두 사용 E14.5 마우스 neurosphere 문화의 NSC 주파수를 결정했다. 모두 나에 의해 결정 E14.5 마우스 neurosphere를의 NSC 주파수thods는 비교할 수 있습니다. NCFCA가 능성이며, 장기 자기 갱신 능력을 가지고 NSCs의를 열거합니다. 우리의 방법에서 NSC 주파수가 NCFCA에서에 필적하기 때문에, 우리의 프로토콜에서 판독은 NSC 주파수를 과대 평가하지 않는 것 같습니다. NCFCA 완료하는 데 삼주을 필요로하며, 주로 세포 도금 및 매체 보충을 포함한다. 여기에 설명 된 프로토콜을 수행 할 수 십삼일 요구 및 단계의 다른 시리즈, 예를 들어, neurosphere 따기 및 면역 염색을 포함한다. 이 프로토콜은 NSCs을 열거 할 수있는 다른 방법이 될 수 있습니다. 연구팀은 샘플에서 NSC 주파수를 확인 NCFCA이 프로토콜을 모두 사용할 수 있습니다.
이러한 프로토콜의 하나의 한계는 중요한 일련의 단계가 있어야 모두 일 제 50 웰 챔버 커버 슬립에 조정 된 배지의 제조 샘플 neurosphere를의 NFU 결정 및 샘플 neurosphere를 전송을 수행 할 필요가 있다는 다 수행Y 8. 하나는이 단계를 완료하려면 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한, 효율적인 방법으로 이러한 단계를 수행하기 위해 실행을 요구한다.
neurosphere를 널리 NSC의 기능과 동작을 연구하는 데 사용되었다. 그러나 neurosphere를이 NSCs의와 NP에 모두 구성되어 있습니다. 그러므로, NSC 생물학을 연구하는 neurosphere를에서 NSCs을을 풍부하게하는 것이 중요하다. 현재, 세포 표면 마커 색소 배제 속성뿐만 아니라 세포의 크기 및 입도 NSCs의 6,7,9-13,29,30 위해 농축하는데 사용되어왔다. 이 프로토콜은 잠재적 NSC NSCs의 마커로의 농축을 정량화하고, 최종 NSC 마커의 검색을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 네 최근의 연구는 NSC 주파수 5,14,15,26을 열거이 프로토콜을 사용하고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 연구에 자금을 지원하기위한 과학, 기술 및 연구 (A * STAR의), 싱가포르의 기관 감사합니다.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |