ल्युकोसैट समृद्ध रक्त के नमूनों में Halogenating peroxidase की गतिविधि के फास्ट और विशिष्ट आकलन
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
इस पत्र में छोटे पूरे रक्त के नमूनों से ल्यूकोसाइट्स का त्वरित और मानकीकृत संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है। यह प्रक्रिया एरिथ्रोसाइट्स की hypotonic सेल पर आधारित है और गैर मानव उत्पत्ति के रक्त के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मानव नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है। के बारे में 50 से 100 μl के छोटे प्रारंभिक नमूना मात्रा इस विधि छोटी प्रयोगशाला जानवरों से आवर्तक रक्त नमूने के लिए लागू करता है। इसके अलावा, ल्युकोसैट संवर्धन मिनट के भीतर और कम सामग्री रसायन और इंस्ट्रूमेंटेशन के बारे में प्रयासों के साथ हासिल की है, इस पद्धति कई प्रयोगशाला वातावरण में लागू कर रही है।
ल्यूकोसाइट्स के मानकीकृत शुद्धि एक अत्यधिक चयनात्मक धुंधला हो जाना, myeloperoxidase (एमपीओ) और हीम पराक्सिडेजों की halogenating peroxidase गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए विधि Eosinophil peroxidase (ईपीओ), यानी, हाइपोक्लोरस और hypobromous एसिड (HOCL और HOBr) के गठन के साथ संयुक्त है। एमपीओ जोरदार neut में व्यक्त किया है जबकिrophils, सबसे प्रचुर मात्रा में मानव रक्त में के रूप में अच्छी तरह से monocytes में प्रतिरक्षा सेल प्रकार, संबंधित एंजाइम ईपीओ विशेष रूप से eosinophils में व्यक्त किया जाता है। इन एंजाइमों के halogenating गतिविधि लगभग HOCl- और HOBr विशेष डाई aminophenyl fluorescein (APF) और प्राथमिक peroxidase सब्सट्रेट हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करके संबोधित किया है। बाद में फ्लो का विश्लेषण करने पर सभी peroxidase पॉजिटिव कोशिकाओं (न्यूट्रोफिल, monocytes, eosinophils) साफ़ कर रहे हैं और उनके halogenating peroxidase गतिविधि मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। चूंकि APF धुंधला कोशिका की सतह मार्करों के आवेदन के साथ जोड़ा जा सकता है, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से संबोधित करने के लिए ल्युकोसैट उप अंशों बढ़ाया जा सकता है। विधि दोनों मानव और कृंतक ल्यूकोसाइट्स में HOCL और HOBr उत्पादन का पता लगाने के लिए लागू है।
जीर्ण सूजन रोगों में इन एंजाइमी उत्पादों की व्यापक रूप से चर्चा की और diversely प्रतिरक्षात्मक भूमिका को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल की एक बेहतर समझ के लिए योगदान कर सकते हैंल्युकोसैट व्युत्पन्न हीम पराक्सिडेजों की रोग प्रतिरोधक प्रासंगिकता।
Introduction
Polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (PMNs, यह भी कहा जाता granulocytes) और monocytes रक्त 1,2 में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण सेलुलर घटकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे रोगजनकों के खिलाफ के रूप में भी प्राप्त कर लिया प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण और एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया 2-4 की दीक्षा के लिए प्राथमिक रक्षा करने के लिए योगदान करते हैं। फिर भी विशेष रूप से न्यूट्रोफिल, granulocytes की सबसे प्रचुर मात्रा में प्रकार, और monocytes भी काफी विनियमन और तीव्र भड़काऊ घटनाओं 5 की समाप्ति के लिए योगदान करते हैं। इसलिए इन कोशिकाओं को भी संधिशोथ 6.7 जैसी पुरानी भड़काऊ रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। तथ्य यह है, अस्थमा, एक जीर्ण सूजन एयरवे रोग में eosinophils का एक बिगड़ा apoptosis, रक्त 8 में दूसरा सबसे granulocyte प्रकार की विशेषता है। फिर भी granulocytes की apoptosis और मैक्रोफेज द्वारा उनके त्वरित हटाने सेलुलर समाप्ति के दौरान दो आवश्यक कदम उठाए हैंसूजन 9-11 की।
नामित प्रतिरक्षा कोशिकाओं दो निकट से संबंधित एंजाइमों, अर्थात् myeloperoxidase (एमपीओ, न्यूट्रोफिल और monocytes) और Eosinophil peroxidase (ईपीओ, eosinophils) में 12,13 पाया जा सकता है। ये हीम पराक्सिडेजों प्रतिष्ठित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में वे दो-इलेक्ट्रॉनिक रूप से oxidize (छद्म) इसी hypo (छद्म) को halides halous एसिड होता है जो उनकी जीवाणुनाशक गुण 14-16 के लिए जाना जाता है से संबंधित हैं। शारीरिक शर्तों के तहत मुख्य रूप से एमपीओ रूपों हाइपोक्लोरस अम्ल (HOCL) और hypothiocyanite (- OSCN) जबकि दूसरा और hypobromous एसिड (HOBr) ईपीओ 17-19 से बनते हैं। नए परिणाम बताते हैं कि इस (छद्म) halogenating एंजाइम गतिविधि भी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के नियमन के लिए और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 20,21 की समाप्ति के लिए योगदान कर सकते हैं। वास्तव में, HOCL उत्पादन एमपीओ और व्युत्पन्न उत्पादों के द्वारा टी सेल आधारित अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 22-2 को दबाने के लिए दिखाया गया है4।
आदेश में यह शारीरिक समारोह को पुरानी भड़काऊ रोगों में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली से ल्यूकोसाइट्स की रोग प्रतिरोधक भूमिका में और अधिक जानकारी हासिल एमपीओ और ईपीओ के योगदान को निर्धारित करने के लिए हम जल्दी से बाद में एक विशेष के लिए छोटे से रक्त के नमूनों से ल्यूकोसाइट्स संतुष्ट करने के लिए एक विधि विकसित इन कोशिकाओं में halogenating peroxidase गतिविधि का निर्धारण। एरिथ्रोसाइट कमी के लिए हम आसुत जल है, जो कम माल की लागत पर एक त्वरित ल्युकोसैट संवर्धन की ओर जाता है के साथ दो-बाद के hypotonic सेल कदम सहित एक मानकीकृत विधि को चुना है। Halogenating एमपीओ के बाद के दृढ़ संकल्प और ईपीओ गतिविधि के लिए HOCl- और HOBr विशेष डाई aminophenyl fluorescein (APF) 25-27 इस्तेमाल किया गया था। Unspecific peroxidase धुंधला तरीकों 28,29 के आवेदन के विपरीत, इस दृष्टिकोण halogenating peroxidase गतिविधि के चुनिंदा पता लगाने, जो अक्सर गंभीर infl पर बिगड़ा हुआ है की अनुमति देता हैammation 30,31।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूट्रोफिल मानव रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स कर रहे हैं peroxidase पॉजिटिव कोशिकाओं के अलगाव अक्सर ही इन कोशिकाओं पर केंद्रित है और घनत्व ढाल centrifugation 38 अन्य ल्यूकोसाइट्स से न्यूट्रोफिल ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
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