Быстрая и конкретная оценка галогенирующего пероксидазной активности в лейкоцитами обогащается проб крови
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
В данной работе протокол для быстрого и стандартизированного обогащения лейкоцитов из небольших образцов цельной крови описана. Эта процедура основана на гипотонического лизиса эритроцитов и может быть применен к человеческому образцов, а также в крови нечеловеческого происхождения. Небольшой начальный объем пробы от около 50 до 100 мкл делает этот метод применим к рецидиву забора крови из мелких лабораторных животных. Кроме того, обогащение лейкоцитов достигается в течение нескольких минут и с низкими усилиями материалов, касающихся химических веществ и приборов, что делает этот метод применяется в нескольких лабораторных условиях.
Унифицированная очистка лейкоцитов в сочетании с высокой селективностью методом окрашивания для оценки галогенирующего пероксидазной активности гема пероксидаз, миелопероксидазы (МРО) и эозинофилов пероксидазы (ЕРО), т.е. образованием хлорноватистой и бромноватистой кислоты (HOCl и HOBr). В то время как MPO сильно выражен в NEUTrophils, самый распространенный тип клеток иммунной в крови человека, а также в моноцитах, соответствующий фермент ЭПО экспрессируется исключительно в эозинофилов. Галоидирующим активность этих ферментов решается с помощью почти HOCl- и HOBr специфичную аминофенил краситель флуоресцеин (ФПА) и первичный пероксидазы пероксид водорода субстрата. При последующем анализе проточной цитометрии все пероксидаза-положительных клеток (нейтрофилы, моноциты, эозинофилы) различимы, и их активность пероксидазы галогенирующего может быть определена количественно. Так как ПФА окрашивание можно комбинировать с применением маркеров клеточной поверхности, этот протокол может быть расширен, чтобы конкретно рассмотреть лейкоцитов подфракций. Метод применим для обнаружения HOCl и HOBr производства как в человеке и в грызунах лейкоцитах.
Учитывая широко и разнообразно обсудили иммунологическая роль этих ферментных препаратов при хронических воспалительных заболеваниях, этот протокол может способствовать лучшему пониманиюиммунологическая значимость лейкоцитарного происхождения гем пероксидазы.
Introduction
Полиморфно – ядерных лейкоцитов (PMNs, называемые также гранулоциты) и моноциты представляют собой важные клеточные компоненты врожденной иммунной системы в 1,2 крови. Они способствуют лучшей защиты от патогенных микроорганизмов, а также к активации приобретенной иммунной системы и инициирования системного воспалительного ответа 2-4. Тем не менее , особенно нейтрофилы, наиболее распространенный тип гранулоцитов и моноцитов также вносят значительный вклад в регуляции и прекращения острых воспалительных явлений 5. Таким образом , эти клетки могут также играть важную роль в хронических воспалительных заболеваний , таких как ревматоидный артрит 6,7. На самом деле, астма, хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризуется нарушением апоптоза эозинофилов, второй наиболее гранулоцитов типа в крови 8. Тем не менее, апоптозом гранулоцитов и их быстрое удаление макрофагами два основных шага в процессе клеточного прекращениявоспаления 9-11.
В названных иммунных клеток два тесно связанных ферментов, а именно миелопероксидазы (МРО, нейтрофилы и моноциты) и эозинофилов пероксидазы (ЕРО, эозинофилов) можно найти 12,13. Эти гем пероксидазы классически связаны с гуморального иммунного ответа , как они два в электронном виде окислить (псевдо-) галогениды к соответствующему гипо (псевдо) halous кислоты , которые известны своими бактерицидными свойствами 14-16. В физиологических условиях MPO в основном формы хлорноватистой кислоты (HOCl) и hypothiocyanite (- OSCN) в то время как последний и бромноватистая кислоты (HOBr) образованы EPO 17-19. Новые результаты свидетельствуют о том, что это (псевдо-) активность фермента галогенирования может также способствовать регуляции воспалительных реакций и к прекращению иммунных реакций 20,21. На самом деле, производство HOCl МРО и полученных из них продуктов были показаны для подавления клеток на основе адаптивного иммунного ответа Т – 22-24.
Для того чтобы получить более полное представление о иммунологической роли лейкоцитов от врожденной иммунной системы при хронических воспалительных заболеваниях, а также определения вклада MPO и ЕПВ к этой физиологической функции мы разработали метод, позволяющий быстро обогащать лейкоциты из небольших образцов крови для последующего специфического определение активности галогенирующего пероксидазы в этих клетках. Для разрушения эритроцита мы выбрали стандартный метод, включая два последующих гипотонических шагов лизиса с дистиллированной водой, что приводит к быстрому обогащению лейкоцитов при низких материальных затратах. Для последующего определения галогенирующего MPO и активности ЕРО HOCl- и HOBr специфические аминофенил краситель флуоресцеин (APF) использовали 25-27. В отличие от применения методов окрашивания неспецифическое пероксидазы 28,29, этот подход позволяет избирательно обнаружение активности галогенирования пероксидазы, которая часто нарушенную при тяжелой Влиянammation 30,31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоциты в крови человека выделение пероксидаза-положительных клеток , фокусирует часто только на этих клетках , и включает в себя отделение нейтрофилы от других лейкоцитах путем центрифугирования в градиенте плотности 38….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
Riferimenti
- Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
- Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
- Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
- Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
- Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
- Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
- Loughran, N. B., O’Connor, B., O’Fagain, C., O’Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
- Zámocký, M., Obinger, C., Torres, E., Ayala, E. M. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. , 7-35 (2010).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
- Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
- Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
- Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
- van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
- Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
- Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
- Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
- Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
- Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
- Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
- Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
- Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
- Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
- Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
- Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
- Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
- Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
- Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
- Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
- Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
- Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
- Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
- Hu, Y., Ashman, R. B. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. , 101-113 (2012).
- Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
- Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils’ oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
- Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
- Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
- Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
- Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
- Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
- Sun, Z. -. N., Liu, F. -. Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
- Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).
