Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
Bu yazıda küçük tam kan örneklerinden lökositlerin hızlı ve standardize zenginleştirme için bir protokol tanımlanmıştır. Bu prosedür, eritrositlerin hipotonik liziz dayalıdır ve insan olmayan kökenli kan hem de insan örnekleri uygulanabilir. yaklaşık 50 ile 100 ul az ilk örnek hacmi küçük laboratuar hayvanlarından tekrarlanan kan örneğinin, bu yöntem uygulanabilir hale getirir. Ayrıca, lökosit zenginleştirme birden laboratuvar ortamlarında bu yöntem uygulanabilir hale dakika içinde ve kimyasallar ve enstrümantasyon konusunda düşük malzeme çabaları ile elde edilir.
Lökositlerin standardize saflaştırma son derece seçici bir hema peroksidaz halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi için boyama yöntemi, miyeloperoksidaz (MPO), eozinofil peroksidaz (EPO) örneğin, hipokloröz ve hipobromus asitinin (HOCI ve HOBr) oluşumu ile birleştirilir. MPO güçlü neut'ait olarak ifade edilirkenrophils, insan kanında olarak monositlerde en bol immün hücre tipi, ilgili enzim EPO özel eozinofil olarak ifade edilir. Bu enzimlerin halojenleme aktivitesi neredeyse HOCl- ve HOBr'nin özgü boya aminofenil fluoresein (APF) ve primer peroksidaz substrat hidrojen peroksit kullanılarak giderilir. daha sonra akım sitometrisi analizi üzerine tüm peroksidaz-pozitif hücrelerin (nötrofiller, monositler, eozinofil) ayırt edilebilir ve halojenleme peroksidaz aktivitesi belirlenebilir. APF lekeli hücre yüzeyi markerlerinin uygulama ile birlikte olabilir için, bu protokol, spesifik olarak, lökosit alt parçacığı gidermek için uzatılabilir. yöntem, insan ve kemirgen lökositleri hem HOCl ve HOBr'nin üretimi tespit etmek için de geçerlidir.
kronik inflamatuvar hastalıklarda bu enzimatik ürünlerin yaygın ve çeşitli şekillerde tartışılan immünolojik rol göz önüne alındığında, bu protokol daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilirlökosit kaynaklı heme peroksidaz immünolojik alaka.
Introduction
Polimorfonükleer lökositler (PMN olarak da adlandırılır granülositler) ve monositler kan 1,2 olarak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücresel bileşenleri temsil eder. Patojenlere karşı ve kazanılmış bağışıklık sistemi aktivasyonu ve sistemik enflamatuar tepki 2-4 başlatılmasından birincil savunma katkıda bulunur. Oysa özellikle nötrofiller, granülosit en bol türü ve monositler de önemli ölçüde akut inflamatuar olayların 5 düzenlenmesi ve fesih katkıda bulunur. Bu nedenle, bu hücreler aynı zamanda römatoid artrit, 6,7 gibi kronik iltihaplı hastalıklarda önemli bir rol oynayabilir. Aslında, astım, kronik enflamasyonlu hava geçiş yolu hastalığı olarak, eozinofil bozulmuş apoptoz, kan 8'de ikinci granülosit Çeşidi ile karakterize edilir. Oysa granülosit apoptoz ve makrofajlar tarafından onların hızlı çıkarma hücresel sonlandırma sırasında iki temel adımlardırinflamasyon 9-11.
Adı bağışıklık hücreleri, iki yakın ilişkili enzimler, yani miyeloperoksidaz (MPO, nötrofiller ve monositler) ve eozinofil peroksidaz (EPO, eozinofiller) 'de 12,13 bulunabilir. Bu hem peroksidazlar klasik iki-elektronik ilgili hipo (sözde) ila (sözde) halidler bakterisid özellikleri 14-16 için bilinen halojen asitleri okside olarak humoral bağışıklık tepkisi ile ilişkilidir. Fizyolojik koşullar altında MPO esas olarak form hipokloröz asit (HOCI) ve hypothiocyanite (- OSCN) ikinci ve hipobromus asit (HOBr'nin) EPO 17-19 oluşturduğu getirilmektedir. Yeni sonuçlar, bu (sözde) halojenasyon enzim aktivitesi aynı zamanda inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde ve bağışıklık reaksiyonları 20,21 feshi katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Aslında, MPO ve elde edilen ürünlerin tarafından HOCl üretimi T hücre tabanlı adaptif immün yanıtları 22-2 bastırmak gösterilmiştir4.
Bu fizyolojik fonksiyonu MPO ve EPO katkısı kronik inflamatuar hastalıklarda doğuştan gelen bağışıklık sisteminden lökositlerin immünolojik rolüne daha fazla anlayışlar kazanmak için ve belirlemek için hızla bir sonraki özgü küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi bu hücrelerde halojenleştirici peroksidaz etkinliğinin belirlenmesi. eritrosit tükenmesi için biz düşük malzeme maliyetleri hızlı bir lökosit zenginleşmeye yol açar damıtılmış su ile iki müteakip hipotonik lizis adımları içeren bir standart yöntem seçtiniz. Sonraki halojenleme MPO belirlenmesi ve EPO faaliyeti için HOCl- ve HOBr'nin özel boya aminofenil floresein (APF) 25-27 kullanılmıştır. Spesifik olmayan peroksidaz boyama yöntemleri 28,29 uygulanması aksine olarak, bu yaklaşım, genellikle ciddi iltihaplanmaya karşı en bozulur halojenleme peroksidaz aktivitesi seçici algılama sağlar,amasyon 30,31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nötrofiller, insan kanından en bol lökositlerdir olarak peroksidaz-pozitif hücrelerinin elde edilmesi çoğu zaman sadece bu hücreler üzerinde odaklanır ve yoğunluk dereceli santrifüj 38 diğer lökositlerin nötrofillerin bir şekilde ayrılmasını da içerir. Nötrofiller daha az bol sıçangil kan örneklerinde henüz olarak ikinci daha karmaşık yöntemleri için 39 40 kullanılmalıdır. Ayrıca her iki yöntemde de bağlı daha büyük kan hacim ihtiyacı için, numunele…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
Riferimenti
- Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
- Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
- Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
- Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
- Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
- Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
- Loughran, N. B., O’Connor, B., O’Fagain, C., O’Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
- Zámocký, M., Obinger, C., Torres, E., Ayala, E. M. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. , 7-35 (2010).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
- Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
- Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
- Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
- van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
- Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
- Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
- Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
- Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
- Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
- Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
- Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
- Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
- Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
- Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
- Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
- Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
- Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
- Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
- Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
- Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
- Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
- Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
- Hu, Y., Ashman, R. B. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. , 101-113 (2012).
- Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
- Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils’ oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
- Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
- Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
- Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
- Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
- Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
- Sun, Z. -. N., Liu, F. -. Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
- Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).
