تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير
Summary
Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.
Abstract
Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.
Introduction
وجود قيود على HIV-1 العلاجات الحالية هو أنها يجب أن تدار بشكل مزمن لمنع تطور المرض. زرع HIV-1 مقاومة T اللمفاوية، أو الخلايا الجذعية المكونة للدم، لديه القدرة على توفير مراقبة طويلة المدى من فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها في غياب العلاج بالعقاقير 1،2 و قد يكون أيضا نهج فعال لتحقيق لعلاج HIV-1 3. طريقة واحدة لجعل خلايا مقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها هي لادخال واحد أو أكثر من الجينات الترميز لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا أو الببتيدات إلى خلايا الفرد المصاب خلال زرع ذاتي 4. وقد صممت مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الجينات العديد من مرشح مع بعض التجارب السريرية التي تدخل في مجموعات من اثنين أو ثلاثة 5 6، لمنع تطور HIV-1 مقاومة أي جين واحد.
مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا هي من بين أكبر المرشحين للالجمع بين العلاج الجيني نظرا لقدرة منخفضة على الحصول على ردود المناعة ولأنهموكتب من تسلسل الجينات قصيرة جدا. وقد صممت بعض مضادات HIV-1 الرنا لاستهداف دخول الفيروس والتكامل. ومع ذلك، فإن معظم لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا تستهدف خطوات ما بعد التكامل في دورة حياة الفيروس (الشكل 1). وتشمل مثبطات بعد التكامل الرنا شرك، واستهداف HIV-1 البروتينات التنظيمية تات أو القس 1، والرنا القائم على العقاقير استهدفت مواقع مختلفة في HIV-1 الحمض النووي الريبي، مثل الريبوزيمات 7، 8 shRNAs وU1i الرنا 9. وتشمل الأساليب التي استخدمت لمقارنة فعالية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1-الرنا رصد تكاثر الفيروس في الخلايا transduced مع جينات ترميز لالرنا مرشح وقياس الانتاج الفيروسية في الخلايا transfected عابر مع البلازميدات التعبير عن الرنا مرشح والتعبير البلازميد HIV-1 10 -13. لقد كانت تستخدم في السابق لإنتاج فحص HIV-1 لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي للمواقع المستهدفة إنزيم الحمض النووي الريبوزي جديد 13-15. ومنذ ذلك الحين تم تنقيح هذه الأساليب لتحسين شكل من RNAتدخل جزيء أعرب عن البلازميد باعتبارها shRNA أو تسليمها باعتبارها سيرنا الاصطناعية (16). الفحص يقيس إنتاج الفيروسات الناضجة من خلايا 293T الإنسان الكلى الجنينية (كلوة)، ويمكن استخدامها لمقارنة آثار مثبطات التي تستهدف الخطوات في مرحلة ما بعد الاندماج في دورة النسخ المتماثل HIV-1 (الشكل 1). لمثبطات التي تستهدف خطوات ما قبل الاندماج، وهناك حاجة إلى فحوصات بديلة مثل-تزم BL خلية العدوى فحص 17 لتقييم فعالية المضادة للفيروسات.
وتشمل مخاوف تتعلق بالسلامة الرئيسية لإيصال مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا في العيادة المحتملة الآثار بعيدا عن الهدف على الرنا أو البروتينات الإنسان، وتفعيل أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية. لتقييم سمية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرناوات siRNAs، وقد استخدمنا مقايسة بقاء الخلية في خطوط مختلفة من الخلايا 16. نحن أيضا قياس تفعيل مزدوجة أجهزة الاستشعار المناعة الحمض النووي الريبي RNA، RNA تنشيط بروتين كيناز R (PKR) وتول مثل مستقبلات 3 (TLR3)، فضلا عن السابقالضغط وللفيروسات تحفيز الجينات، P150 ADAR1. هذه المقايسات يمكن استخدامها للتأكد من فعالية لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا لا يرجع إلى الآثار غير المباشرة على بقاء الخلية أو تفعيل جهاز الاستشعار المناعي. كما أنها مفيدة في استبعاد الرنا مرشح مع سمية محتملة من مزيد من التطوير.
في البروتوكولات التالية، الإجراءات الخاصة بتحديد الرنا علاجية جديدة وتحسين توصف شكل القائمة. طرق مفيدة لفحص الحمض النووي الريبي تستند مثبطات بعد دمج HIV-1 تكرارها ويمكن تكييفها لفحص مثبطات بعد التكامل الأخرى، مثل الجزيئات الصغيرة التي تستهدف القس تصدير بوساطة من الحمض النووي الريبي الفيروسي 18 أو كريسبر / نظم كاس مصممة لاستهداف متكامل HIV-1 الحمض النووي (19).
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تنفيذ إنتاج فحص HIV-1 صفها باستخدام خلايا HEK293T (الشكل 2) ومشابه لفحوصات المستخدمة لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي لإنزيم الحمض النووي الريبوزي فعال 13، shRNA 10،29، سيرنا 30، وU1i RNA مواقع 11،31 الهدف. باستخدام أساليب مختلفة لتحديد إنتاج HIV-1، وقياس …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل المقدم هنا من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (يمنح DCB-120266، PPP-133377 وHBF-348967 لAG).
Materials
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL – Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
Riferimenti
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev – mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
