복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비
Summary
우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다.
Abstract
척수 조각에서 전기 생리 녹음은 네트워크 속성에 휴대 질문의 넓은 범위를 조사 할 가치있는 기술을 입증했다. 우리는 젊은 쥐 (- P11 P2)의 척수의 가능한 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비에서의 motoneurons은 축삭은 척수의 복부 뿌리에서 나오는 유지한다. 이 축색 돌기의 자극은 척수 내에서 motoneuron의 somas과 흥미로운 motoneuron의 담보 침입 다시 전파 활동 전위를 이끌어. antidromic 활동 전위의 기록은 다른 식별 방법을 능가 motoneuron 정체성을 특성화하기 위해, 즉시 확정하고 우아한 방법입니다. 또한, motoneuron의 담보를 자극하는 기타 운동 신경원 또는 R와 척수 내에서 운동 신경원의 담보 타겟을 자극하는 간단하고 신뢰성있는 방법은세포를 enshaw. 이 프로토콜에서는, 우리는 복부 루트 자극의 결과는 motoneuron somas뿐만 아니라 렌쇼 세포 여기에서 antidromic 녹음을 제시한다.
Introduction
역사적으로, 날카로운 전극을 사용 motoneuron 녹음은 고양이 나 쥐 1이나 마우스 2에서 격리 된 전체 척수에 큰 동물 생체 내에서 실시 하였다. somas 필요한 밀봉과 motoneuron에 직접 액세스를 요구 1980 년대 패치 클램프 녹음 기술의 출현은, 시각적 인지도하에 달성 될 수있다. 따라서, 척수 슬라이스 제조 용이 1990 세 이후 달성되었다. 그러나, 초기 슬라이스 준비는 종종 복부 뿌리의 자극을 허용하지 않았다. 우리가 아는 한, 두 연구는 가로 조각의 복부 뿌리를 성공적으로 자극을보고, 아무도는 마우스 4,5에서 얻은되지 않았다.
motoneuron 풀은 복부 루트를 벗어나지 축삭을 유지하는 – (P11 P2)이 문서에서 우리는 신생아 쥐의 생존 척수 조각을 달성하기 위해 기술을 제시한다. 벤트RAL 루트 자극은 같은 복부 루트에서 배출되는 motoneuron 풀의 somas에 다시 antidromic 활동 전위를 트리거합니다. 또한 motoneuron 담보 타겟 다른 운동 신경원 6-10 및 11-13 렌쇼 세포를 여기. 단지의 motoneurons은 복부 뿌리를 자신의 축삭을 보낼 수 있기 때문에, 우리의 motoneurons (10)를 식별 physiologicaly하는 간단하고 확실한 방법으로 antidromic 활동 전위의 기록을 사용합니다.
motoneuron 신원을 확인하기 위해 잠재적으로 비 포함되거나 잘못된 전기 생리 학적 및 criterions에를 사용하는 것 외에도, 척수 운동 신경원에 대한 최근의 연구는 또한 사후 지루하고 시간 소모적 16 염색에 의존. 이러한 식별은 보통 기록 세포 샘플에 대해 수행된다. 다른 식별 전략은 내인성 운동 신경원 형광을 발현하는 마우스 선에 의존 <sup> 17 ~ 19. 이 연구는 이미 유전자 변형 마우스 줄을 사용하여 필요한 경우 마커의 발현은 여전히 변수 또는 그러나 유전자 인코딩 된 마커를 사용하여 젊은 나이에 어려울 수 있습니다. 대안 적으로, antidromic 활동 전위 기록은 셀 기록의 시작에서 모든 마우스에서 일상적으로 수행 될 수있다. 고양이, 쥐와 마우스에서 손상 척수 준비 작업 실험자은 확실하게 1950 년대 1,2,20,21 이후 같은 식별 기술을 사용했다. 최적의 조건에서 우리는 기록의 motoneurons의 거의 모든에서 antidromic 활동 전위를 유도 할 수 있었다.
또한, 복부 루트 자극을 확실하게 다른 운동 신경원 22, 23 또는 이들의 타겟을 자극하기 위해 사용될 수있다. 렌쇼 세포 10,24,25. 우리는 여기에 motoneuron somas antidromic에서 활동 전위 기록 형태 복부 루트 자극의 응용뿐만 아니라 렌쇼 세포의 자극을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그것은, 신뢰할 수있는 포괄적이고 구체적인 방법으로 하나의 척추 세그먼트에서 motoneuron 풀과 렌쇼 세포의 일방적 인 자극을 허용하기 때문에 척수의 경사 슬라이스가 중요합니다. 또한, 기록의 motoneurons의 빠른 우아하고 비 모호한 식별 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 다른 슬라이스 준비 방법에 비해이 기술의 장점을 강조하며, 우리는이 절차를 수행하는 동안 피할 수있는 가장 일반적인 함…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 사진을 찍는 그들의 도움 마린 마누엘과 올리비아 골드만-Szwajkajzer 감사합니다. 저자는 또한 원고를 교정하기위한 아르 준 Masukar과 토비아스 복을 주셔서 감사합니다. 금융 지원은 라 공들인 (HYPER-국방부, ANR-2010 BLAN-1429-01)을 부어 직원은 국립 제공 한은 NIH – NINDS (R01NS077863)의 티에리 Latran 재단 (OHEX 프로젝트), 근육 병증에 대한 프랑스 협회 ( 승인 번호 16026) 및 대상 ALS는 기꺼이 인정한다. 펠릭스 리로이는 고등 사범 학교, Cachan의에서 "Contrat 박사"의받는 사람이었다.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
Riferimenti
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d’Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O’Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d’Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O’Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower’s tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O’Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
