משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em> זבוב הפירות הים תיכוני</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) הוא מין הדברה עם הרלוונטיות חקלאיות גבוהות מאוד. זאת בשל התנהגות הרבייה שלה: נקבות לפגום במשטח החיצוני של פרות וירקות כאשר הם מטילים ביצים ואת הזנת הזחלים בקעו על העיסה שלהם. Wild ג אוכלוסיות capitata נשלטות באופן מסורתי באמצעות דברת ריסוס ו / או גישות ידידותיות לסביבה, המצליחות ביותר להיות טכניקת חרקי סטרילי (SIT). לשבת מסתמך על-גידול המוני, עיקור מבוסס קרינה בתחום שחרור הזכרים שומרים ליכולתם להזדווג, אבל הם לא מסוגלים להפיק צאצאים פוריים. ההופעה ואת ההתפתחות המהירה הבאה של כלים ביוטכנולוגיים, יחד עם הזמינות של רצף הגנום medfly, שהגביר מאוד את הבנתנו את הביולוגיה של מין זה. זה העדיף ההתפשטות של אסטרטגיות חדשות עבור מניפולציה הגנום, אשר can להיות מיושם על שליטה באוכלוסייה.
בהקשר זה, microinjection העובר ממלא תפקיד כפול בהרחבת ארגז הכלים לבקרת medfly. היכולת להפריע לתפקוד של גנים המווסתים תהליכים ביולוגיים מפתח, אכן, מרחיב את הבנתנו את המנגנון המולקולרי שבבסיס הפולשנות medfly. יתר על כן, היכולת להשיג שינוי הניבט אונליין הופכת לפשוט את הייצור של זנים מהונדסים רבים שיכולים להיבדק עבור יישומים בתחום בעתיד במסגרות SIT רומן. אכן, ניתן להשתמש מניפולציה גנטית להעניק תכונות רצויות שיכולות, למשל, לשמש כדי לפקח על הביצועים זכר סטרילי בתחום, או שיכול לגרום הקטלניות החיים בשלב מוקדם. כאן אנו מתארים שיטה microinject חומצות גרעין לעוברי medfly להשיג שתי מטרות עיקריות אלה.
Introduction
זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata הוא מין קוסמופוליטי כי פירות נזקים בהרחבה וגידולים מעובדים. זה שייך למשפחת Tephritidae, הכוללת מינים מזיקים שונים, כגון השייכים לסוגים Bactrocera ו Anastrepha. Medfly הוא המין הנחקר ביותר של המשפחה הזו, והיא הפכה להיות דוגמא ומופת לא רק לחקר פלישות חרקי 1, אלא גם עבור אופטימיזציה של אסטרטגיות במזיקי 2.
Medfly הוא מין multivoltine שיכול לתקוף יותר מ -300 מינים של בר צמחי תרבות 3,4. הנזק נגרם על ידי שני מבוגרים בשלבים הזחל: הנקבות הזדווגו לחדור את פני השטח של הפרי עבור ההטלה, המאפשר מיקרואורגניזמים כדי להשפיע על איכות המסחרי שלהם, ואילו את ההזנה הזחלים על עיסת הפירות. לאחר שלושה שלבי זחל, זחלים יוצאים מן המארח pupate לתוך האדמה. Ceratitiscapitata מציג חלוקה כמעט כלל עולמי, כולל אפריקה, המזרח התיכון, מערב אוסטרליה, מרכז ודרום אמריקה, אירופה, ותחומי בארצות הברית 5.
האסטרטגיות הנפוצות ביותר להגביל מכת medfly כרוכה בשימוש חומר הדברה (למשל, malathion, Spinosad) ואת טכניקת סטרילית החרקים הידידותית לסביבה (SIT) 6. הגישה האחרונה כרוכה שחרור לטבע של מאות אלפי גברים שניתנו סטרילי על ידי חשיפה קרינה מייננת. ההזדווגות של זכרים מעוקרים כגון לנקבות בטבע התוצאה לא צאצאים, גרימת ירידה בגודל אוכלוסייה, המובילה בסופו של דבר לחיסול. למרות SIT הוכיח יעילות קמפיינים רבים מרחבי העולם, החסרונות העיקריים שלה כוללים את העלויות הגבוהות של גידול וטיהור מיליוני חרקים להשתחרר. סימון של אנשים שוחררו יש להבחין סטרילי מפני חרקים בטבע שנתפסו בשטח במהלךניטור פעילויות וזה מושג כיום באמצעות אבקות ניאון. נהלים אלה הם יקרים ויש לי 7 תופעות לוואי בלתי רצוי.
על מנת לייעל ו / או לפתח גישות יעילות יותר של השליטה על המזיק הזה, ביולוגיה והגנטיקה medfly נחקרו באופן נרחב על ידי חוקרים רבים ברחבי העולם. הזמינות של רצף הגנום medfly 8,9, תקל חקירות רומן על פונקציות גן. התערבות RNA הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים כאלה וזה יכול להיות מושגת באמצעות microinjection של dsRNA (RNA פעמיים תקועים) או siRNA (RNA התערבות קטנה). טכניקה זו נעשתה שימוש, למשל, על מנת להוכיח כי המפל המולקולרי קביעת הזוויג ב C. capitata נשמרת באופן חלקי בלבד ביחס לזה של תסיסנית 10.
הפיתוח של פרוטוקולי microinject עובר medfly מותר ג capitata להיות בלתי הראשוןמיני זבוב -Drosophilid להיות מהונדסים גנטי. כפי ביציו דומות לאלו של תסיסנית, הן מבחינת מורפולוגיה ועמידות בפני התייבשות 11, פרוטוקול להעביר דנ"א פלסמיד לעוברי טרום blastoderm הראשון שפותח עבור ד melanogaster 12,13 בתחילה הותאם לשימוש ב C. capitata. הניסויים הראשונים אפשרו טרנספורמציה נבט אונליין medfly מבוסס על טרנספוזון מינוס 11. בהמשך לכך, המערכת המקורית שונתה 14 תוך שימוש בגישות transposon מבוסס אחרים. זהו המקרה של piggyBac מן פרפראים Trichoplusia ni 15. הפרוטוקול מאז מותאם יותר וזה התיר טרנספורמציה של מיני tephritid אחרים 16-21 וגם של רבים אחרים Diptera 22-31. כל המערכות הללו מסתמכות על השימוש של מערכת טרנספורמציה פלסמיד וקטור / עוזר בינארי אופיינית: מלאכותי, transpo הפגוםבנים שיישאו את הגנים הרצויים הם התאספו לתוך ה- DNA פלסמיד והשתלבו הגנום של החרק על ידי אספקת האנזים transposase 32. מספר קווי medfly המהונדסים נוצר, עם תכונות רבות, כוללים זני נושאת גן קטלני דומיננטי מותנה שגרם קטלני, זנים בייצור צאצאים לגברים בלבד ובכך לא מחייב אסטרטגיות זיהוי מין באמצעים נוספות, זנים עם זרע פלורסנט, אשר עשוי לשפר את הדיוק שלב ניטור SIT 33-37. למרות שחרורו בטבע של האורגניזם מהונדס שחל בדיקות טייס נגד יתושים רק 38,39, לפחות חברה אחת בוחנת מספר זני medfly המהונדסים לשימושם בתחום 40.
microinjection העובר יכול גם לטובת פיתוח כלים הגנום עריכה חדשים, כגון nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs), חזרות palindromic קצר interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / CRISPR הקשורים nuclease חלבון 9 (Cas9) וגנים endonucleases ביות (HEGs), אשר יאפשר מחקרים האבולוציוניים וההתפתחותיים הרומן, כמו גם הרחבת ארגז הכלים ביוטכנולוגיים זמין. גישות הגנום עריכה כבר מותרות דור מערכות כונן גני יתושים 41, והעבירו אל medfly הוא קרוב. כאן אנו מתארים פרוטוקול אוניברסלי עבור microinjecting חומצות גרעין בעוברים medfly שיכול להיות שימושי עבור כל היישומים הנ"ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjection של חומצות גרעין בעוברי חרקים הוא טכניקה אוניברסלית המאפשרת הוא הניתוח של תפקוד גן ויישומים ביוטכנולוגיים.
הפרסום האחרון של רצפי גנום ממספר גדל והולך של מיני חרקים מוביל צורך דחוף כלים לאפיון הפונקציונלי של גנים של פונקצ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
Riferimenti
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetica. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
- Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
