Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em> Ceratitis capitata</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
La mouche méditerranéenne des fruits (mouche méditerranéenne) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) est une espèce nuisible avec pertinence agricole extrêmement élevé. Cela est dû à son comportement de reproduction: les femelles endommagent la surface externe des fruits et légumes quand ils pondent des œufs et les larves se nourrissent hachurée sur leur pulpe. Sauvage C. populations capitata sont traditionnellement contrôlés par pulvérisation d' insecticides et / ou des approches écologiques, le plus de succès étant la technique de l' insecte stérile (TIS). Le SIT repose sur l'élevage en masse, la stérilisation à base de rayonnement et la dissémination des hommes qui conservent leur capacité à accoupler, mais ne sont pas en mesure de générer une descendance fertile. L'avènement et le développement rapide subséquente des outils biotechnologiques, ainsi que la disponibilité de la séquence du génome de la mouche méditerranéenne, a considérablement renforcé notre compréhension de la biologie de cette espèce. Cela favorisait la prolifération de nouvelles stratégies pour la manipulation du génome, qui can être appliquée au contrôle de la population.
Dans ce contexte, l'embryon microinjection joue un double rôle dans l'expansion de la boîte à outils pour le contrôle de la mouche méditerranéenne. La capacité à interférer avec la fonction des gènes qui régulent les processus biologiques clés, en effet, élargit notre compréhension du mécanisme moléculaire sous-jacente invasivité mouche méditerranéenne. En outre, la capacité de réaliser la transformation de la lignée germinale facilite la production de multiples souches transgéniques qui peuvent être testées pour les futures applications sur le terrain dans de nouveaux paramètres de SIT. En effet, la manipulation génétique peut être utilisé pour conférer des traits désirables qui peuvent, par exemple, être utilisés pour surveiller la performance des mâles stériles dans le domaine, ou qui peut entraîner au début de la létalité de stades de vie. Nous décrivons ici une méthode pour micro-injection des acides nucléiques dans des embryons de mouches méditerranéennes pour atteindre ces deux objectifs principaux.
Introduction
La mouche méditerranéenne des fruits (mouche méditerranéenne) Ceratitis capitata est une espèce cosmopolite que intensivement dommages fruits et plantes cultivées. Il appartient à la famille des Tephritidae, qui comprend plusieurs espèces de parasites, tels que ceux appartenant aux genres Bactrocera et Anastrepha. La mouche méditerranéenne est l'espèce la plus étudiée de cette famille, et il est devenu un modèle non seulement pour l'étude des invasions d' insectes 1, mais aussi pour l' optimisation des stratégies de lutte antiparasitaire 2.
La mouche méditerranéenne est une espèce multivoltines qui peuvent attaquer plus de 300 espèces de sauvages et les plantes cultivées 3,4. Le dommage est causé par les adultes et les stades larvaires: femelles fécondées percent la surface du fruit pour la ponte, ce qui permet des micro-organismes d'affecter leur qualité commerciale, alors que les larves se nourrissent de la pulpe de fruits. Après trois stades larvaires, les larves émergent de l'hôte et se nymphosent dans le sol. Ceratitiscapitata affiche une répartition presque dans le monde entier, y compris l' Afrique, le Moyen-Orient, en Australie occidentale, centrale et Amérique du Sud, en Europe et régions des États-Unis 5.
Les stratégies les plus communes pour limiter les infestations de mouches méditerranéennes impliquent l'utilisation d'insecticides (par exemple, Malathion, spinosad) et respectueux de l' environnement Technique de l' insecte stérile (TIS) 6. Cette dernière approche implique la libération dans la nature des centaines de milliers de mâles rendus stériles par exposition à une irradiation ionisante. L'accouplement de ces mâles stérilisés aux femelles sauvages se traduit par aucune descendance, ce qui provoque une réduction de la taille de la population, pour aboutir finalement à l'éradication. Bien que le SIT a prouvé son efficacité dans de multiples campagnes dans le monde entier, ses principaux inconvénients comprennent les coûts élevés de l'élevage et de stérilisation des millions d'insectes à être libéré. Marquage des individus relâchés est nécessaire de distinguer stérile des insectes sauvages capturés sur le terrain pendantles activités de surveillance et il est actuellement réalisé en utilisant des poudres fluorescentes. Ces procédures sont coûteuses et ont des effets secondaires indésirables 7.
Afin d'optimiser et / ou de développer des approches plus efficaces pour le contrôle de ce ravageur, la biologie et la génétique mouche méditerranéenne ont été largement exploré par de nombreux chercheurs dans le monde entier. La disponibilité de la séquence du génome de la mouche méditerranéenne 8,9, facilitera de nouvelles enquêtes sur les fonctions des gènes. l'interférence ARN est un outil puissant pour de telles études et il peut être atteint par la microinjection d'ARNdb (en ARN double brin) ou siRNA (petits ARN interférents). Cette technique a été utilisée, par exemple, pour démontrer que la cascade moléculaire de détermination du sexe chez C. capitata est partiellement conservée par rapport à celle de la drosophile 10.
Le développement des protocoles à micro – injection d' embryons permis C. mouche méditerranéenne capitata d'être le premier nonespèces de mouches -Drosophilid à être génétiquement modifiées. Comme ses œufs sont semblables à ceux de la drosophile, tant en termes de morphologie et de la résistance à la dessiccation 11, le protocole pour délivrer l' ADN plasmidique dans des embryons pré-blastoderme premier développés pour D. melanogaster 12,13 a été initialement conçu pour être utilisé en C. capitata. Ces premières expériences ont permis la transformation de la mouche méditerranéenne lignée germinale sur la base des éléments transposables Minos 11. Par la suite, a été modifié le système d' origine 14 à l' aide d' autres approches à base de transposons. Tel est le cas de piggyBac de lépidoptères 15 Trichoplusia ni. Le protocole a depuis été optimisé, ce qui a permis la transformation d'autres espèces téphritides 16-21 ainsi que de nombreux autres diptères 22-31. Tous ces systèmes reposent sur l'utilisation d'un système typique de vecteur binaire / auxiliaire de transformation: plasmide artificiel, transp défectueuseles fils contenant les gènes souhaités sont assemblés dans l' ADN plasmidique et intégré dans le génome de l'insecte en fournissant l'enzyme transposase 32. Un certain nombre de lignes de mouches méditerranéennes transgéniques ont été générées, avec de multiples fonctionnalités, y compris des souches portant un gène létal dominant conditionnel qui induit la létalité, les souches produisant exclusivement masculine descendance et ne nécessitant donc pas de stratégies de sexage supplémentaires, et les souches avec le sperme fluorescent, qui peut améliorer la précision de la phase de surveillance SIT 33-37. Bien que la libération dans la nature des organismes transgéniques a eu lieu dans des essais pilotes contre les moustiques seulement 38,39, au moins une entreprise évalue un certain nombre de souches transgéniques pour leur mouche méditerranéenne utilisation dans le domaine 40.
Embryo microinjection peut également favoriser le développement de nouveaux outils génome-édition, telles que la transcription nucléases activateurs comme effecteurs (Talens), regroupées répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) / CRISPR protéine associée 9 nucléase (cas9) et endonucléases homing gènes (HEGs), ce qui permettra de nouvelles études sur l'évolution et le développement, ainsi que l'expansion de la boîte à outils biotechnologiques disponibles. Approches Genome-édition déjà permis à la génération de systèmes de gènes entraînement chez les moustiques 41, et leur transfert à la mouche méditerranéenne est imminente. Nous décrivons ici un protocole universel pour microinjection acides nucléiques dans des embryons qui peuvent être la mouche méditerranéenne utile pour toutes les applications mentionnées ci-dessus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjection d'acides nucléiques dans les embryons d'insectes est une technique universelle qui facilite à la fois l'analyse de la fonction génique et des applications biotechnologiques.
La publication récente des séquences génomiques provenant d'un nombre croissant d'espèces d'insectes conduit à un besoin urgent d'outils pour la caractérisation fonctionnelle des gènes de fonction inconnue encore. L' ARN interférence est avérée être une des mé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
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