Summary
תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.
Abstract
קבלות רבות קיימות בין תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקות, למרות תסיסנית חסרות את שושלת הלימפה מאפיינות חסינות אדפטיבית יונקת. תסיסנית hematopoiesis יונק להתרחש שלבים ברורים במרחב ובזמן כדי לייצר כמה שושלות תאי דם. שני המערכות לשמור מאגרים של אבות תא דם שבה להרחיב או להחליף שושלות בוגרות. מערכת hematopoietic מאפשרת תסיסנית ויונק להגיב ולהתאים לאתגרים חיסוניים. חשוב לציין, הרגולטורים תעתיק מסלולי איתות השולטים הדור, תחזוקה, והתפקוד של מערכת hematopoietic שמורים מפני זבובים ליונקים. דמיון אלה מאפשרים תסיסנית לשמש לפיתוח ומחלות hematopoietic מודל גנטי.
כאן אנו מבחני פרט לבחון את מערכת hematopoietic של הזחלים תסיסנית. בבפרט, אנו המתאר שיטות למדוד במספרי תא דם וריכוז, לדמיין שושלת בוגרת ספציפית in vivo, ולבצע אימונוהיסטוכימיה על תאי דם שבמחזור באיבר hematopoietic. מבחנים אלה יכולים לגלות שינויים בביטוי גנים ואת תהליכים תאיים כולל איתות, הישרדות, התפשטות, בידול יכולים לשמש כדי לחקור מגוון רחב של שאלות הנוגעות hematopoiesis. בשילוב עם הכלים הגנטיים הזמינים תסיסנית, יכולים לשמש מבחנים אלה כדי להעריך את מערכת hematopoietic על שינויים גנטיים מוגדרים. אמנם לא התווה במיוחד כאן, מבחנים אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את השפעת שינויים סביבתיים, כגון זיהום או דיאטה, על מערכת hematopoietic.
Introduction
המנגנונים המורכבים המסדירים את גורמי שעתוק מסלולי איתות כי לתאם את הפיתוח של מערכת hematopoietic וכי תקלה במחלות המטולוגיות להישאר ממעטים להבין. גורמי שעתוק אלה מסלולי איתות, כמו גם הוויסות שלהם, הם שמורים ביותר בין תסיסנית יונקי hematopoiesis 1-5. לכן מערכת hematopoietic תסיסנית מייצגת מודל גנטי מעולה להגדיר את המנגנונים המולקולריים השולטים hematopoiesis ומחלות המטולוגיות בסיסיות.
בדומה ליונקים, תסיסנית ליצור תאי דם, המכונה hemocytes, ב במרחב ובזמן שלבים ברורים של hematopoiesis. באופן מסורתי, hematopoiesis תסיסנית נחשב להיות מוגבל שלבי ביניים mesoderm העוברי בבלוטת הלימפה הזחל. מחקרים שנעשו לאחרונה לספק ראיות כי hematopoiesis מתרחשת גם CLU נייחים הזחלsters והן מבוגר בטן 6-8. כל שלבי hematopoietic לייצר שני סוגים של hemocytes הבוגרת: plasmatocytes ותאי קריסטל. Plasmatocytes הם תאים דמויי מקרופאג מעורב phagocytosis, חסינות מולדת, וריפוי פצעים. תאים קריסטל מכילים פרו-phenoloxidases הנדרשים melanization, תגובה המשמשת תגובות חיסוניות חרקים וריפוי פצעים. Hematopoiesis זחל יכול ליצור סוג hemocyte בוגרת שלישי, שנקרא lamellocyte, בתגובה לאתגרי חיסון מסוימים כגון זיהום צרעה טפיל 9,10. Lamellocytes גדול, תאים חסידים המתפקדים, בשיתוף עם plasmatocytes ותאי קריסטל, לתמצת ולנטרל ביצי צרעה הניחו זחלים תסיסנית. בהעדר parasitization, lamellocytes לא נמצא זחלי wild-type. המוני Melanotic להידמות ביצי צרעת melanized, כמוסות; רבי זנים תסיסנית מוטציה לפתח המוני melanotic בהעדר parasitization. הנוכחות של lamellocytes ו / או המוני melanotic יכול להצביע על ליקויי hematopoietic. למעשה, את הפנוטיפ המוני melanotic נעשה שימוש כדי לזהות גנים ושבילים מעורבים hematopoiesis 11-14.
מערכת hematopoietic הזחל הוא נרחב ביותר למד עד כה. היא מורכבת hemocytes במחזור hemolymph, אשכולות hemocyte נייחים בדוגמת תחת לציפורן, ו hemocytes המתגוררים בלוטת הלימפה. בלוטת הלימפה היא סדרה של אונות הבילטרליים מצורפות הכלי הגבה. כל אונה העיקרית של בלוטת הלימפה מחולקת לשלושה אזורים עיקריים. האזור החיצוני ידוע כאזור קליפת המוח ומכיל התבגרות hemocytes. האזור הפנימי ביותר נקרא האזור מדולרי והיא מורכבת מבשרי hemocyte שקטים. האזור השלישי, במרכז איתות האחורי, הוא קבוצה קטנה של תאים בבסיס של בלוטת הלימפה אשר פועלת נישה דמוית תא גזע. עבודה מוקדמת הוקמה פונקציות קריטיות עבור Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18, ו כנפי 21 פעילות להסדיר התפתחות בלוטת הלימפה זחל. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי BMP 22, FGF-ראס 23, ו היפו 24,25 איתות גם לתפקד בתוך בלוטת הלימפה הזחל.
ארבעה מבחני hematopoietic הזחל המפורטים כאן לתאר 1) מדידת מחזורי ריכוז hemocyte, מוגדר כמספר של תאים ליחידת נפח, 2) בידוד ותיקון במחזור hemocytes אימונוהיסטוכימיה, 3) חזותי בתאי קריסטל in vivo, ו -4) לנתח, לתקן, ואת הרכבה הלימפה בלוטות אימונוהיסטוכימיה. מבחנים אלה יכולים לשמש readouts hematopoietic להעריך את הפונקציות והתקנות של מסלולי איתות במערכת hematopoietic הזחל. בעוד שיטות אלה שמשו בעבר בתחום, תיעוד חזותי של מבחנים אלה החל רק לאחרונה 8,26-30. מספר פרסומים שצוטטו כאן הם לעזרהמשאבי פול המתארים בשיטות דומות וסמני hematopoietic 26,31-33. בנוסף, Trol וויקינג הם סמנים השימושיים של קרום במרתף בלוטת הלימפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. במחזור ריכוז Hemocyte
- כדי להשיג זחלים של השלב ההתפתחותי בערך אותו הדבר עבור assay זה, להגביל אוסף ביצה בכך שהוא מאפשר לנקבות להטיל ביצים לתקופת זמן קבועה של 2 - 6 שעות.
- אסוף הזחלים לנתח בארות צלחת מלא בופר פוספט 1x (PBS, טבלה 1).
- עבור כל זחל, מקום 10 μl 1x PBS בצינור microcentrifuge על הקרח 10 μl 1x PBS על כרית לנתח נקי. מניח את המשטח לנתח על בסיס סטראו מואר.
- היבש היה מונח זחל פרט על ידי הצבתו על רקמה לנגב לפני והעברתה ירידת PBS על הכרית לנתיחה.
- בעזרת זוג מלקחיים, בעדינות לקרוע פתוח ובזהירות להפוך לציפורן כדי לשחרר את hemolymph.
הערה: שים לב שלא לגרד או תוקע את לציפורן כמו זה עלול לשחרר hemocytes הנייח 29. - שימוש pipet, לאסוף את hemolymph מהפנקס לנתח. הימנע שיתוףllecting פסולת זחל כגון השומן בגוף.
- מוסיפים את hemolymph לצינור microcentrifuge ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה.
הערה: דגימות כמה ניתן לאסוף מיד ושמרה על הקרח עד שעה. - אופציונאלי: מערבבים כחולים Trypan עם מדגם hemolymph בחלקים שווים לצבוע או לא לכלול תאים מתים. ספירת תאים בתוך 3 דקות של הוספת כחול Trypan כי זה רעיל לתאים.
- מערבבים את המדגם על ידי pipetting למעלה ולמטה לפני טעינת 10 μl לתוך תא hemocytometer.
- אם אתה משתמש נגד תא אוטומטי, להגדיר את הפרמטרים מתאימים בגודלם מעגלי תא. לדוגמא, להגדיר גודל תא מינימום של 2 מיקרומטר, גודל תא מקסימאלי של 22 מיקרומטר, ואת המעגליות של 75 - 80% עגלגלים לזהות נורמלי, עגול hemocytes 34. ניסוי עם פרמטרים שונים כדי לזהות hemocytes גדול דמוי כישור, כגון lamellocytes. לחלופין, השתמש hemocytometer לספור hemocytes ידני.
2. Circulating Hemocyte אימונוהיסטוכימיה
- כדי להשיג זחלים של השלב ההתפתחותי בערך אותו הדבר עבור assay זה, להגביל אוסף ביצה בכך שהוא מאפשר לנקבות להטיל ביצים לתקופת זמן קבועה של 2 - 6 שעות.
- מניחים coverslip אחד בכל טוב של צלחת 6- או 12 גם.
הערה: coverslips ריבוע (22 מ"מ) בכושר 6 צלחות היטב coverslips עגול (18 מ"מ קוטר) בכושר 12 גם צלחות. - אסוף זחלים לנתח בארות צלחת מלאות 1x PBS.
- מקום 5 μl 1x PBS במרכז כל coverslip.
- מניחים את הצלחת על בסיס סטראו מואר.
- היבש היה מונח זחל פרט על רקמה לנגב ולאחר מכן למקם את PBS על coverslip.
- בעזרת זוג מלקחיים, בעדינות לקרוע ובזהירות להפוך לציפורן. לפני הסרת פגר הזחל, להשתמש בו כדי להפיץ את hemolymph באופן שווה.
הערה: שים לב שלא לגרד או תוקע את לציפורן כמו זה עלול לשחרר hemocytes הנייח 29. - RepeaT עבור כל הזחלים, איסוף hemolymph של זחל אחד לכל coverslip. אפשר hemocytes לדבוק coverslips במשך 5 -. 8 דקות ב RT בטמפרטורת החדר אל יעלה על 30 דקות לפני קיבעון.
- תקן hemocytes ידי הוספת 5 μl של 7.5% פורמלדהיד (טבלה 1) לכל coverslip במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף coverslips שלוש פעמים עם 1X PBS. העצה הצליח לשאוב PBS לאחר כל שטיפה. כדי למנוע נגר של הפתרון permeabilization בשלב הבא, השתמש aspirator להסיר PBS עודף ההיקף של coverslips.
- הוספת 100 פתרון permeabilization μl (טבלה 1) לכל coverslip במשך 20 דקות ב RT.
- עצה לטפוח בעדינות את הצלחת לשאוב את פתרון permeabilization.
- לדלל נוגדן ראשוני עם פתרון נוגדנים (טבלה 1) על פי מפרט של הספק. הוסף לפחות 500 μl פתרון נוגדן ראשוני coverslips ב 12 גם צלחות.הוסף לפחות 1.5 מ"ל 6 צלחות היטב. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- הסר את פתרון הנוגדן הראשוני ולשטוף coverslips עם 1x PBS במשך 10 דקות על שייקר מסלולית, שלוש פעמים.
- לדלל נוגדנים משני עם פתרון נוגדן על פי המפרט של הספק. הוסף לפחות 500 פתרון נוגדנים משני μl כדי coverslips ב 12 גם צלחות. הוסף לפחות 1.5 מ"ל עבור 6 צלחות היטב. דגירה במשך שעה לפחות 2 ב RT.
- הסר את הפתרון נוגדנים משני ולשטוף coverslips עם 1x PBS במשך 10 דקות על שייקר מסלולית כמו בשלב 2.10, שלוש פעמים.
- במהלך השלבים לשטוף, מיקרוסקופ זכוכית נקי שקופיות עם 70% אתנול (טבלה 1) השימוש במגבונים רקמות. עבור כל coverslip, מקום 5 μl הרכבה חיץ (טבלה 1) בשקופית זכוכית.
הערה: שני coverslips להתאים בשקופית אחת. - לשאוב לשטוף PBS הסופי.
- שימוש במלקחיים כדי להסיר את coverslips בזהירות מהצלחות והמקום, inverted, על גבי החיץ הגובר.
הערה: שקופיות מיקרוסקופ יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לפני הדמיה. זמן אחסון מרבי תלוי ביציבות של הנוגדנים בשימוש. 6 ו 12 גם צלחות ניתן לשטוף ולעשות בהם שימוש חוזר.
3. melanization Cell Vivo קריסטל
- כדי להשיג זחלים של השלב ההתפתחותי בערך אותו הדבר עבור assay זה, להגביל אוסף ביצה בכך שהוא מאפשר לנקבות להטיל ביצים לתקופת זמן קבועה של 2-6 שעות.
- לפני ההתחלה, להגדיר מקור חימום על 60 מעלות צלזיוס.
הערה: תכנית Cycler תרמית של 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (ואחריו אחיזת C 25 °) עובדת הכי טובה, אבל באמבט מים או מקור חימום אחר הוא מספיק כל עוד החום מופץ באופן עקבי באופן שווה על פני כל זחל. - אסוף הזחלים לנתח בארות צלחת מלא 1x PBS (טבלה 1).
- אחת בכל פעם, לייבש זחל על רקמה לנגב ומקום בתחתית צינור PCR. מניחים כל זחלבתוך שפופרת PCR נפרדת. (ראה איור 3 א.)
- לקבלת תוצאות עקביות, להבטיח שהשהייה הזחלים בתחתית הצינורות PCR ידי מצמרר הזחלים צינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 - 15 דקות ו / או נוגע קלות צינורות לפני החימום.
- מניחים את הצינורות PCR Cycler התרמית (או אמבט מים). מחממים על 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- מוציא בזהירות זחלים מן צינורות PCR לתוך לנתח בארות צלחת מלאות PBS 1x הטרי.
- זחלים יבשים על רקמה לנגב ומסדרים על משטח שטוח עבור הדמיה תחת סטראו.
- ציון תמונות של זחלים באופן עיוור על ידי אנשים רבים.
4. הזחל לימפה בלוטת אימונוהיסטוכימיה
הערה: בלוטת הלימפה ממוקמת כ אורך שליש מן הקצה הקדמי של זחל מעט מתחת המוח בצד הגבי. (ראה חץ באיור 3 ב.) בלוטת הלימפה חביות כלי הגבי והוא גזור ביותר בקלות מצורפת hoo הפהks או למוח. Wild-type, בלוטות לימפה instar השלישי הן מבנים קטנים מאוד; האונות העיקריות הן כ 100 - 200 מיקרומטר באורך. (ראה איור 4 א.)
- כדי להשיג זחלים של השלב ההתפתחותי בערך אותו הדבר עבור assay זה, להגביל אוסף ביצה בכך שהוא מאפשר לנקבות להטיל ביצים לתקופת זמן קבועה של 2 - 6 שעות.
- לנתיחה בלוטת לימפה
- עבור כל תנאי הניסוי, להוסיף 1 מ"ל 1x PBS (טבלה 1) כדי אחד טוב של צלחת 24 גם.
- להוסיף 1 טיפה של 0.1% PBST (טבלה 1) זה טוב באמצעות pipet העברה חד פעמיות.
הערה: חומרי ניקוי, כגון Tween 20, מתווסף להקטין את מתח הפנים, המאפשר הרקמה לשקוע לתחתית הבאר. - מניחים את צלחת שטוחה על הקרח.
- אסוף זחלים לנתח בארות צלחת מלאות 1x PBS.
- הניחו כרית לנתח נקי על בסיס סטראו מואר. השתמש pipet העברת הפנויה למקום small טיפות של 0.01% PBST (טבלה 1) על כן השיגור. עבר זחל אחד לירידת PBST לנתיחה.
- החזק את הזחל עם זוג אחד של מלקחיים כ אורך רבע מן הקצה האחורי, למעלה בצד הגבי.
- השתמש עוד זוג מלקחיים לתפוס לציפורן מיד קדמית מלקחיים כי מחזיקים הזחל. משוך בעדינות את העור המת לקראת הסוף הקדמי עד ווי הפה חשופים.
הערה: המטרה היא לקלף את העור המת מבלי להפריע כל מבנים פנימיים. - שחרר את העור המת להשתמש בשני מלקחיים לחתוך הזחל לשניים. הסר את הקצה האחורי מירידת PBST.
הערה: אם לציפורן לא לקלף כל הדרך אל פי הווים, לחתוך את הזחל בשני ולהסיר את הקצה האחורי. השתמש זוג אחד של מלקחיים להחזיק את הקצה של לציפורן, ולהשתמש הזוג האחר של מלקחיים לדחוף את פי הווים דרך הפתח. זה יהיה להפוך את העור המת ולחשוף את הפה ווים. זה יכול לשמש alternכמו גם אכלתי שיטה לנתיחה. - השתמש זוג אחד של מלקחיים להצמיד לציפורן (או לציפורן הגחון, דש לציפורן הגב, או שניהם) ליציבות.
- שימוש נוסף זוג המלקחיים לתפוס את פי ווים החשופים בעדינות למשוך אותם החוצה.
הערה: זה יהיה להפריד את לציפורן מן המבנים הפנימיים. באופן אידיאלי, העין / דיסקים דמותי מחושים, מוח, בלוטת טבעת, ואת בלוטת הלימפה איגוף הכלי הגבה תישאר מחוברת ווי הפה. - בעוד עדיין מחזיק את פי הווים, להסיר בזהירות מבנים לא רצויים כגון בלוטות רוק, שומן גוף, ומעי.
הערה: אם המוח מפריד בין פי הווים, בלוטת הלימפה עדיין מוצמדת אל ואסף עם המוח. במקרה זה, להחזיק חוט עצב הגחון במקום ווי הפה. - באמצעות ווי הפה או חוט עצב גחון כידית, להעביר את מורכבות גזור המכילות את בלוטת הלימפה אל הבאר על קרח. האם לא יעלה על 30 דקותלפני הקיבוע.
- קיבוע אימונוהיסטוכימיה
- מניחים את צלחת 24 גם על בסיס סטראו.
- השתמש פיפטה p200 להסיר את PBST בזהירות מן הבאר.
הערה: רוקן, בארות שכנה שימושיות להפקיד פסולת באופן זמני. - בעדינות להוסיף 200 μl 3.7% פורמלדהיד (טבלת 1) לאורך הצד של הבאר לערבל את הצלחת על מנת להבטיח כי הרקמות הגזורות שקועות לגמרי.
- מחזירים את הצלחת אל קרח למשך 30 דקות. אם בלוטות הלימפה להביע חלבון פלואורסצנטי (ים), לשמור על צלחת מכוסה כדי למנוע photobleaching.
- השתמש פיפטה p200 להסיר את מקבע בזהירות.
- לשטוף ידי הוספת 200 μl 1x PBS לבאר והצבת את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש פיפטה p200 להסיר את PBS בזהירות.
הערה: קבוע בלוטות הלימפה ניתן להשאיר על הקרח PBS עד בלוטות הלימפה עבור כל תנאי הניסוי הם דissected וקבוע. - חזור על לשטוף צעדים עוד פעמיים.
- הוספת 200 פתרון permeabilization μl (טבלה 1) אל הבאר. הגדר את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 45 דקות ב RT.
הערה: דקות 45 הוא "תקן הזהב" עבור permeabilization בלוטת הלימפה אבל יש סופרים הצלחה רק לאחר 20 דקות. - הסר את הפתרון עם טפטפת p200.
- לדלל נוגדן ראשוני עם פתרון נוגדנים (טבלה 1) על פי מפרט של הספק. הוספת 300 μl פתרון נוגדן ראשונים הבאר ולהבטיח כי הרקמות הגזורות שקועות לגמרי. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- השתמש פיפטה p200 להסיר את הנוגדן הראשוני.
- לשטוף ידי הוספת 200 μl 1x PBS לבאר והצבת את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש פיפטה p200 להסיר את PBS בזהירות.
- חזור על לשטוף צעדים עוד פעמיים.
- לדלל משניntibody עם פתרון נוגדן על פי המפרט של הספק. הוספת 300 פתרון נוגדנים משני μl לבאר ולהבטיח כי הרקמות הגזורות שקועות לגמרי. דגירה על שייקר מסלולית במשך שעה לפחות 2 ב RT.
- השתמש פיפטה p200 להסיר את נוגדנים משני ולשטוף כמתואר בשלבים 4.3.12 & 4.3.13. אין להסיר את PBS לאחר לשטוף הסופי.
- הלימפה הרכבה בלוטת
- מיקרוסקופ זכוכית נקי שקופיות באמצעות אתנול 70% (טבלה 1) ומגבונים רקמות.
- עבור כל תנאי הניסוי, למקם טיפה אחת של הרכבה חיץ (טבלה 1) בשקופית זכוכית.
הערה: שני תנאים מתאימים בשקופית אחת. הרכבת נפח מאגר תלויה במספר בלוטות הלימפה כדי להיות מותקן. השתמש 2 μl כ 18 - 20 בלוטות לימפה, 1 μl במשך 10 - 12, ו -0.5 μl במשך 5 או פחות. - מניחים את השקף מיקרוסקופ על בסיס סטראו מואר.
- עבור עד שני תנאים בכל פעם, להעביר את כל בלוטות הלימפה מן הבאר למאגר הגובר עם מלקחיים, באמצעות פי ווים או חוט עצב גחון כידית.
- שטח הרקמות הגזורות באופן שווה בתוך צורה עגולה או מלבנית, הפצת החיץ גובר בתהליך.
- עבור כל אחת הרקמות הגזורות, בנפרד, החלק טונג אחד המלקחיים תחת הכלי הגבה ומשכו בעדינות כלפי הפריפריה של החיץ הגובר.
הערה: זה ימשוך את לימפה בלוטה החוצה משאר הרקמות הגזורות ולשטח הבלוטה לימפה על הזכוכית. - שימוש טונג אחד המלקחיים ובקשת ניסור, לחתוך כלי מגבה בין בלוטת הלימפה והמוח.
- הזז את שאר הרקמות הגזורות אל הצד השני של בלוטת הלימפה, בקצה החיצוני של למאגר.
ההערה: הרקמות הגזורות הרצויות בסופו של דבר תהווינה היקפיות מסביב לבלוטות הלימפה לשמש תמיכה על which את coverslip ינוח. - חזור על פעולה עד כל בלוטות הלימפה מופרדים מן הרקמות הגזורות, בהזמנה אחד של רקמות הגזורות הרצויות להציב במרכז.
- קח coverslip בין שתי אצבעות. בדוק כי coverslip היא ללא אבק וטביעות אצבעות. במידת הצורך, השתמש במטלית לנגב ו -70% אתנול לנקות את coverslip.
- הבטיח כי בקצה coverslip הוא במקביל לקצה של שקופית הזכוכית, בזהירות להוריד את coverslip על החיץ הגובר.
ניתן לאחסן שקופיות מיקרוסקופ על 4 מעלות צלזיוס לפני הדמיה: הערה. זמן אחסון מרבי תלוי ביציבות של הנוגדנים בשימוש. 24 גם צלחות ניתן לשטוף ולעשות בהם שימוש חוזר.
הדמיה 5.
- תמונה קבועה hemocytes רכובה בלוטות לימפה על קרינת תקן מתאימה או מיקרוסקופ confocal בהגדלת 20X ומעלה על פי הוראות ההפעלה של היצרן. זחלי תמונה שלמים על סטנדסטראו ARD בהגדלת 2X פי הוראות ההפעלה של היצרן.
- עקוב אחר ההוראות של ספק תוכנה עבור פישוט, אם תרצה בכך.
| פִּתָרוֹן | הרכב | אִחסוּן | תגובות |
| 1x PBS | 200 מ"ג / L אשלגן כלוריד | טמפרטורת חדר | |
| 200 מ"ג / L אשלגן פוספט monobasic | |||
| נתרן כלורי 8,000 מ"ג / L | |||
| 1,150 מ"ג / L dibasic פוספט נתרן | |||
| DH 2 O | |||
| מְיַצֵב | 3.7% או 7.5% פורמלדהיד ב 1x PBS | בטמפרטורת החדר בחושך | פורמלדהיד הוא רעיל. |
| פתרון Permeabilization / diluent נוגדן | 0.4% טריטון | 4 ° C | הנוסחה הסטנדרטית משתמשת 0.4% טריטון אבל המחברים להשתמש 0.1% Tween 20 עם הצלחה. השתמש כדי לדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים פי ריכוזים המומלצים של הספקיות. |
| 5% אלבומין בסרום שור, עז בסרום נורמלי, או חמור בדם נורמלי | |||
| 1x PBS | |||
| אתנול 70% | 70% 200 הוכחה אתנול dH2O | טמפרטורת חדר | |
| חיץ שמה | 0.5% N-propyl gallate | 4 ° C בחושך | N-propyl gallate מזיק. DAPI הוא mutagen. |
| גליצרול 80% | |||
| אופציונלי: 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) | |||
| 1x PBS | |||
| 0.1% PBST | 0.1% Tween 20 ב 1x PBS | טמפרטורת חדר | |
| 0.01% PBST | דילול 1:10 של 0.1% PBST | טמפרטורת חדר |
פתרונות לוח 1. שימוש בפרוטוקול זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחזור ריכוז Hemocyte
מספרים Hemocyte ותגבר במהלך התפתחות הזחל 35. כדי להמחיש כי שיטה זו מזהה הבדלים במספרי hemocyte וריכוז, ללא קשר לסיבה הביולוגית, מדדנו ריכוזי hemocyte של זחלים מתעכבים ולא להתעכב. פסד של הורמון prothoracicotropic (ptth) על ידי אבלציה גנטי של תאי עצב מייצרי ptth (ptth> עגום) מייצר עיכוב התפתחות זחל 36. עבור כל גנוטיפ, ריכוזי hemocyte נמדדו כמתואר בפרוטוקול 1 לפחות זחל 8 בודד הרים במהירות של 25 ° C. ב 120 שעות לאחר אוסף ביצה 2 hr, ריכוז hemocyte הממוצע זחל מתעכב (ptth> עגום) הוא פחות ריכוז hemocyte הממוצע זחל מלא (ptth). רק לאחר 9 ימים עושה את ריכוז hemocyte הממוצע גישת זחל איחור של בקרות (
תמונות שנלקחו נגד תא אוטומטי להראות מדגם hemolymph נקי, רצוי מדגם המכיל פסולת, אשר עלול להוביל מדידה מדויקת (התרשים 1C). בגדלי תא מינימום ומקסימום נקבעו 2 מיקרומטר ו 22 מיקרומטר, בהתאמה. מעגלי נקבע עגלגלות 75-80%. פרמטרים אלו נועדו כקווים מנחים וצריכים להיות מותאמים באופן אמפירי.
במחזור Hemocyte אימונוהיסטוכימיה
Hemocytes במחזור לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) נאספו, קבוע, וטופחו בתערובת של נוגדנים plasmatocyte ספציפי (P1a ו P1b, אישטוון אנדו) 31 כמתואר בפרוטוקול 2(איור 2). התמונה צולמה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי מוצגת ללא שינוי לאחר deconvolution איטרטיבי המאולץ. במקרה זה, deconvolution לא שיפר את איכות התמונה באופן דרסטי.
In vivo קריסטל נייד melanization
הזחלים הונחו בתחתית צינורות PCR לפני melanization תא קריסטל לחמם נגרם כמתואר בפרוטוקול 3 (איור 3 א). החיצים האדומים מציינים צינורות שבו הזחלים נמצאים רחוק מדי לתחתית עלול להיות מחומם בצורה לא אחידה. חלוקה לא שווה של חום על פני זחל בודד יכולה להגדיל השתנות melanization של תאי גביש בתוך הזחל.
זחל wild-type צלם על סטראו סטנדרטי מציג את הדפוס האופייני של תאי קריסטל melanized באשכולות נייחים לאחר חשיפה לחום (איור 3 ב). תאי קריסטל Melanized בבלוטת הלימפה לפעמים נראים.
הזחל לימפה בלוטת אימונוהיסטוכימיה
Instar השלישי בלוטות הלימפה הזחל נותחו, קבוע, רכוב כמתואר בפרוטוקול 4. תמונה בעלת ניגודיות הפרעות ההפרש (DIC) נלקח על מיקרוסקופ פלואורסצנטי תקן מציגה את האונות בלוטת הלימפה יסודי ותיכון איגוף כלי הגבי (איור 4 א).
בלוטת לימפה שבו אזור מדולרי ומרכז האחורי איתות סומנו גנטית עם חלבון פלואורסצנטי כחול משופר (EBFP2) ו- GFP, בהתאמה, היה מוכתם נוגדן כנגד תחום תאיים Notch (C17.9C6, לימודי התפתחותית Hybridoma בנק) כמו המתואר פרוטוקול 4. תמונות מחסנית Z נלקחו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. Int מקסימלית אחת הקרנת תמונת ensity מופיעה ללא שינוי לאחר deconvolution איטרטיבי המוגבל (האיור 4B). במקרה זה, deconvolution דרסטי שיפר את איכות ופרטים של התמונה.
איור 1. במחזור ריכוז Hemocyte. א) חלק בינוני תקן תסיסנית הוסר (מימין) כדי לקדם את הטלת ביצים במהלך תקופה אוספת 2 hr ביצה. ב) ריכוז hemocyte הממוצע זחל מתעכב התפתחותית (ptth> עגום) היה נמוך יותר מאשר ריכוז hemocyte הממוצע זחלים מלאים (ptth) 120 שעות לאחר ההטלה (AEL). ריכוז hemocyte הממוצע זחל מתעכב ניגש שליטה ברמה 9 ימים AEL. ברי שגיאה לייצג ± SEM C) דגימות Hemolymph ללא (משמאל) עם (מימין) פסולת. ברי סולם מייצגים 0.1 מ"מ.יעד href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. במחזור Hemocyte אימונוהיסטוכימיה. Hemocytes גנטית להביע GFP נאספו קבוע כדי coverslip. נוגדן ספציפי plasmatocyte שמש plasmatocytes הכתם (אדום). מכתים DAPI מוצג בכחול. תמונה ללא שינוי נלקחה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (משמאל). אותה תמונה לאחר deconvolution (מימין). ברי סולם מייצגים 50 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Vivo א) הזחלים הונחו בנפרד צינורות PCR לפני החימום. חיצים אדומים מציינים זחלים שאינם בתחתית הצינורות B) דפוס melanization תא גביש בדרך כלל אחרי החימום, שלפעמים מגלה בלוטת הלימפה (חץ;. הגבה בצד לעין, קדמי הוא עזב). סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. זחל לימפה בלוטת אימונוהיסטוכימיה. א) תמונת DIC של בלוטת הלימפה השלישי instar זחל מראה את ספינת הגב (DV), אונות עיקרית (1 °), ואת אונות משנית (2 מעלות). סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. ב) instar השלישי נציג f בלוטת הלימפה הזחלrom זחל גנטית לבטא EBFP2 באזור מדולרי ו- GFP במרכז איתות האחורי. בלוטת לימפה היה מוכתם נוגדן כנגד תחום תאיים Notch (אדום). תמונה ללא שינוי נלקחה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (למעלה). אותה תמונה לאחר deconvolution (למטה). ברי סולם מייצגים 20 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם השינוי גנטי או סביבתי, ארבע השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש בנפרד או בשילוב לנתח תהליכים שונים במהלך hematopoiesis כגון איתות, הישרדות, שגשוג, והבחנת hematopoiesis תסיסנית היא תהליך דינאמי.; מספר hemocytes לכל חיה מגדיל 35 והביטוי מבנה הגן של בלוטת הלימפה משנה 32 במהלך הפיתוח. לפני ביצוע מבחנים אלה, ולכן, חשוב להגביל אוספי ביצים בכך שהוא מאפשר לנקבות להטיל ביצים עבור כמות קבועה של זמן וכדי לאשר את השלב ההתפתחותי הזחל הרצוי. אוספי ביצה קצרים (פחות מ -6 שעות) או מקרים שבם נקבות אינן בריאות או נדירות, הטלת ביצים יכולה להיות מעודד יצירת סדקים בתוך האוכל. ניתן להשיג זאת על ידי הסרת חלק מזון עם מרית לניקוי אתנול. אם נוזל עודף מצטבר מזון, רקמות שימוש מגבונים כדי לספוג אתנוזל. (ראה איור 1 א.)
לבד, השיטות שתוארו כאן יש מגבלות. למשל, מדידת ריכוז hemocyte במחזור לוכדת שינויים בהישרדות hemocyte או התפשטות אבל מספק שום מידע על חלוקת שושלת hemocyte או כל שיבוש שושלת שעשויה להיות תוצאה אל שינוי גנטי או סביבתי. לעומת זאת, אימונוהיסטוכימיה של מחזורי hemocytes מגלה שינויים שושלות hemocyte ספציפי hemolymph אבל רק יחסית, לא מוחלטת, מספרים. קריסטל תא melanization in vivo קשה לכמת כמו חלוקת תא גביש הוא משתנה hemocytes הנייח הוא 8,10 דינמי. במקום זאת, אנשים רבים צריכים להבקיע תא קריסטל melanization בעיוורון. לבסוף, תצפיות שנעשו תא hemocyte אחד לא בהכרח להתייחס בתאים אחרים.
כאשר נעשה שימוש יחד, מבחנים אלו יכולים להיות מיושמים להבחין גןשינויי טיק מווסתי התרבות מהירות או שרידה מאלה המווסתים ביטוי או בידול גן. למשל, שינוי גנטי יכול להגדיל התפשטות של hemocytes כך שעולה ריכוז hemocyte אבל הפרופורציות היחסיות של שושלות hemocyte נשארה זהה. לחלופין, שינוי גנטי יכול לקדם שינויי בידול hemocyte לתוך שושלות ספציפיות ללא השפעה על ריכוז hemocyte הכוללת. אוכלוסיית תאי קריסטל יכולה להיחקר במהירות ובקלות תוך שימוש בשיטת melanization vivo, הקלת מסכים גנטיים מחקרי אינטראקציה גנטיים. שיטה זו יכולה לשמש תימוכין עם מחקרים גנטיים לנצל prophenoloxidase 1 (PPO1, גם תאים שחור שנקרא, BC) אללים מוטנטים או מבחני immunohistochemical לנצל נוגדנים ספציפיים תא קריסטל. בלוטת הלימפה הזחל יכול לשמש כדי לענות על שאלות דומות לגבי תהליכים תאיים hematopoietic. רַבִּיםמסלולי איתות מעורבים בהקמה ואחזקת בלוטת הלימפה והאזורים הגדולים שלה. לכל אזור ביטוי גנים ברור ולתפקד hematopoiesis זחל. בנוסף, ניצול בלוטת הלימפה יכול לחשוף פונקציות אוטונומיות ובלתי אוטונומיות בתוך אזורי בלוטת הלימפה או hemocytes בלוטת הלימפה.
שיטות רלוונטיות ללימוד hematopoiesis תסיסנית נערכו משאבים מקיפים מבוסס טקסט 26,27 רק לאחרונה. למרות הכרחי לתחום, משאבים אלה מוגבלים בהיקפם. שיטות למדידת ריכוז hemocyte, למשל, לא נכללו. שיטות נכתבו, במיוחד אלה טכניקות לנתיחה מתארות, יכולות להיות מאתגרות לשלוט במהירות. תרומות נוספות נעשו, מתן משאבים חזותיים כדי לסייע עם שיטות, אבל עדיין היו מוגבלות במספר ובהיקף 28,29. השיטות שתוארו כאן, בעוד גם לא מקיף, להוסיף את משאבי available לסייע בחקר hematopoiesis תסיסנית.
אנו מציעים שינויים וחלופות פרוטוקולים קיימים. לדוגמא, ישנם מספר יתרונות למדידת ריכוז hemocyte עם דלפק תא אוטומטי ולא hemocytometer ידני, כולל מהירות מוגברת, קל, ואובייקטיביות. מניסיוננו, באמצעות באמבט מים כדי לחמם זחלים להדמית תא הגביש הביא תוצאות משתנות נרחב, במיוחד אם הזחלים מחוממים הצלוחיות שבו הם גדלים. זחלי חימום צינורות PCR בודדים ניב פחות תוצאות משתנות ועוד לשחזור. השיטה לנתיחה בלוטת הלימפה המתוארת כאן, למרות שתואר קודם לכן בפרוטוקול כתוב 26, מספק אלטרנטיבה אזכור חזותי הקיים 28. לבסוף, אם גישת מיקרוסקופ confocal מוגבלת, אנו מציעים deconvolution של תמונות קרינה סטנדרטיות יכול להיות תחליף הולם תמונות confocal. Deconvolutiעל אלגוריתמים גם להסיר או להקצות מחדש מחוץ הפוקוס שנתפס אור על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי, שיפור רזולוציה וחדות דומים עקרונית חיסול האור של הפוקוס על ידי מיקרוסקופיה confocal, והוא יכול להיות מיושם על 2-ממדי 3- תמונות תלת ממדיות (Z-stack). עבור יישומים מסוימים, כפי שמודגם כאן, deconvolution יכול לשפר את התמונות באופן דרמטי שצולמו מיקרוסקופים פלואורסצנטי קונבנציונאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או פיננסיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M.
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M.
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M.
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
