Abstract
Nylige fiber-bundle microendoscopy teknikker gør det muligt ikke-invasiv analyse af in vivo væv ved hjælp af enten billeddannende teknikker eller en kombination af spektroskopiteknikker. Kombinere imaging og spektroskopi teknikker i en enkelt optisk sonde kan give en mere komplet analyse af væv sundhed. I denne artikel er to forskellige modaliteter kombineret, høj opløsning fluorescens microendoscopy billedbehandling og diffus reflektans spektroskopi, i en enkelt optisk sonde. Høj opløsning fluorescens microendoscopy billeddannelse er en teknik, der anvendes til at visualisere apikal væv mikroarkitektur, og selvom det meste en kvalitativ teknik, har vist effektiv tidstro differentiering mellem neoplastiske og ikke-neoplastiske væv. Diffus reflektans spektroskopi er en teknik, som kan udtrække væv fysiologiske parametre herunder lokal hæmoglobinkoncentration, melanin koncentration, og iltmætning. Denne artikel beskriver specifikationerne required at konstruere fiberoptisk probe, hvordan man opbygger den instrumentering, og derefter demonstrerer teknikken på in vivo menneskehud. Dette arbejde viste, at væv mikroarkitektur, specifikt apikale hudkeratinocyter, kan co-registreret med dens tilknyttede fysiologiske parametre. Instrumenter og fiber-bundle probe præsenteres her kan optimeres som enten en håndholdt eller endoskopisk-kompatibel enhed til brug i en række forskellige organsystemer. Der er behov for yderligere klinisk forskning for at afprøve holdbarheden af denne teknik til forskellige epitel sygdomstilstande.
Introduction
Fiber-bundle microendoscopy teknikker typisk analysere in vivo væv ved hjælp af enten billedbehandling teknikker eller en kombination af spektroskopi teknikker. 1-3 En sådan billeddannelse teknik, høj opløsning fluorescens microendoscopy, kan billede apikale tissue micro-arkitektur med sub-cellulær opløsning i en lille , mikroskala field-of-view, ved anvendelse af et topisk kontrastmiddel såsom proflavin, fluorescein, eller pyranin blæk. 1,3-11 Denne billeddannelsesmodalitet har vist lovende kliniske resultater i kvalitativt differentiere syge og raske epitelvæv i realtid med lav inter-observatør variation. 8. Lejlighedsvis, vil efterforskerne bruge høj opløsning fluorescens mikroskopi data til at udtrække kvantitative funktioner såsom celle og nuklear størrelse eller kirtel område, men det er fortsat et primært kvalitativ teknik rettet mod visualisering af væv morfologi. 1,3,8- 10 på den anden side, spektroskopiteknikker, såsomsom diffus reflektans spektroskopi, er rettet mod at give funktionel væv oplysninger og har vist lovende kliniske resultater i kvantitativt identificere kræft i flere organer. 2,12-15
Der er derfor et behov for en indretning, der inkorporerer begge typer af modaliteter til potentielt yderligere at reducere inter-observatør variation, vedligeholde tidstro visualisering af væv mikroarkitektur, og give en mere fuldstændig analyse af væv sundhed. For at opnå dette mål, blev en multimodal sonde-instrument konstrueret, der kombinerer to modaliteter i en enkelt fiberoptisk probe:. Høj opløsning fluorescens microendoscopy og sub-diffus reflektans spektroskopi 11 Denne metode co-registre kvalitative høj opløsning billeder af apikal vævsmorfologi (strukturelle egenskaber) med kvantitativ spektral information (funktionelle egenskaber) fra to forskellige væv dybder herunder lokal hæmoglobinkoncentration ([Hb]), melanin koncentration ([Mel]), og iltmætning (SAO 2). 11,12,16 Denne specifikke sub-diffus reflektans spektroskopi modalitet bruger to source-detektor adskillelser (sikkerhedsdatablade) at prøve to unikke væv dybder til at give et mere omfattende billede af væv sundhed ved prøvetagning ned til basalmembranen og underliggende væv stroma. 11
Fiberen-probe består af en central 1 mm diameter billedoverføringsfiberen med omkring 50.000 4.5 um diameter fiberelementer, en beklædning diameter på 1,1 mm og en samlet belægning diameter på 1,2 mm. Billedoverføringsfiberen er omgivet af fem 200 um diameter fibre med beklædning diameter på 220 um. Hver 200 um multimode fiber er placeret en center-til-center afstand på 864 um væk fra centrum af billedet fiber. Hver af de 200 um multimodale fibre er 25 ° fra hinanden. Brug af den yderste venstre 200 um multimode fiber som "kilde" fiber, og den yderligere three 200 um multimode fibre som "indsamling" fibre, denne geometri nødvendigvis skaber tre center-til-center SDS'er af 374 um, 730 um, 1051 um, og 1323 um. De fiber tip er omgivet af en cylindrisk metalhus, der holder afstandene mellem fibrene konstant. Diameteren af den cylindriske metalhus er 3 mm. Den distale ende (mod fiberoptiske sonde spids) af det fiberoptiske probe er 2 fod lang. Sonden derefter adskilles i de seks respektive individuelle fibre ved den proximale ende (mod instrumentering), som er yderligere 2 fod lang, for en samlet længde på 4 fod. Figur 1 viser en repræsentation af det fiberoptiske probe.
Figur 1:. Fiberoptiske probe design fiberoptisk probe består af en 1 mm-diameter billedoverføringsfiberen og fire 200 um multimode fibre. DenneFiguren viser gengivelser af (a) metallet endehætte som begrænser geometrien af fibrene ved enden af sonden til opnåelse SDS'er af 374, 730, og 1.051 um i forhold til den yderste venstre 200 um multimode fiber (Scale bar ≈ 1 mm), (b) fibrene være begrænset i metal cap, viser fiber kerner, fiberkappe, og fibercoatingen (Scale bar ≈ 1 mm), (c) den beskyttende polyamid beklædningen omkring fibre (Scale bar ≈ 1 mm), (d ) det færdige distale spids af sonden, med metallet fingergrebet og enkelt sort kabel, der indeholder alle fibre (Scale bar ≈ 4 mm), og (e) et billede af den distale spids af sonden (Scale bar ≈ 4 mm). klik her for at se en større version af dette tal.
Denne multimodal instrumentering og tilhørende technique er den første kombination af disse modaliteter inden for en enkelt sonde, selv om andre kombinerede strukturelle / funktionelle teknikker findes der kombinerer forskellige modaliteter. For eksempel hyperspektral imaging kombinerer bred felt billeddannelse med kvantitative hæmoglobin og melanin egenskaber, 17,18 og andre teknikker er blevet udviklet, som kombinerer optisk kohærens tomografi (OCT) med analyse af væv protein-ekspression, 19 for at nævne et par stykker. Denne artikel rapporter om en kompakt og let at gennemføre instrumentering setup, der bruger en generel fiberoptisk probe, som kan optimeres til forskellige formål, herunder endoskopisk brug i den nedre mavetarmkanal og spiserøret eller som en håndholdt probe til anvendelse i mundhulen og ekstern placering hud. 11,20
Hardwaren for denne instrumentering kræver både brugerdefinerede datafangst og efterbehandling kode for at erhverve diffus reflektans spektre og derefter udtrække den resulterende volume-gennemsnit væv fysiologiske parametre, herunder [Hb], [Mel], og São 2. Købet brugerdefinerede data kode blev bygget til at tillade den samtidige erhvervelse fra et kamera (for høj opløsning fluorescensmikroskopi) og et spektrometer (for diffus reflektans spektroskopi). Chauffører er ofte tilgængelige fra fabrikanternes websteder for at muliggøre integration med en række forskellige programmeringssprog. Den brugerdefinerede efterbehandling kode importerer a priori absorptionsværdier af in vivo [Hb] og [Mel] 21 og udnytter derefter en tidligere udviklet lineær optimering montering proces, der skaber en monteret kurve af spektrene. 22 tilpassede kurve er bygget ved at minimere χ 2 værdi mellem sig selv og den rå spektre og bestemmelse af væv fysiologiske parametre ([Hb], [Mel], og SAO 2) fra den tilpassede kurve og med den laveste χ 2 værdien. 22 koden kan modificeres til at indbefatteabsorption fra andre chromophorer samt, såsom den exogene pyranin blæk, der bruges her, så mål fysiologiske parametre er upåvirkede.
Fysiologiske indikatorer væv sundhed, såsom [Hb], [Mel], og Sao 2, kan anvendes som rapporter om tumor respons på terapi eller som indikatorer for lokal vaskularisering og angiogenese. 14,23 Herunder en høj opløsning fluorescens microendoscopy modalitet hjælper guide sonde placering og giver efterforskerne med et mere komplet billede af forholdet mellem epitelvæv struktur og funktion. I denne artikel, konstruktion og anvendelse af den multimodale microendoscope beskrives. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Review Board godkendelse (IRB # 15-09-149) blev opnået fra forsøgspersoner Forskningsprogram på University of Arkansas for alle aspekter af denne undersøgelse. De beskrevne metoder blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer, og informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.
1. Montering af høj opløsning Fluorescens Microendoscopy Modalitet
Bemærk: kan visualiseres De skitserede trin til samling af høj opløsning fluorescens microendoscopy modalitet i figur 2.
- Placer en 470 nm Dichroic Mirror Inde i en 30 mm Cage Cube.
- Anskaf en 30 mm bur terning og fjern dichroic filter mount.
- Placer en 470 nm dikroisk spejl i dichroic filter mount.
- Re-insert og sikre dichroic filter montere tilbage inde i buret terning.
- Vedhæft huskonstruktion Rods til 30 mm Cage Cube.
- Sikkerfire 1,5 tommer huskonstruktion stænger til forsiden af buret terning.
- Secure fire 3,0 tommer huskonstruktion stænger til højre side af buret terningen.
- Sikker to 2,0 tommer bur montage stænger diagonalt på venstre side af buret terning.
- Byg en Cage Plate / Lens Tube Assembly.
- Opnå en 1,0 tommer gevind forsynet 30 mm bur plade og vedlægge en stress fri holdering til indersiden af buret plade med det medfølgende trådning.
- Skrue i en 1,0 tommer linse rør til stress-fri holdering.
- Vedhæfte en anden 1,0 tommer gevind forsynet 30 mm bur pladen til 1,0 tommer linse rør og justere faste låsestifter således at de to huspladerne flugter.
- Skub 1,0 tommer Cage Plate / Lens Tube Assembly på Venstre side af 30 mm Cage Cube.
- Byg retvinklet spejl mount montage.
- Anskaf en retvinklet spejl mount og en 1,0 tommer UV-forstærket aluminium spejl.
- Placer 1,0 inch UV-forstærket aluminium spejl i spejlet montere og spænd.
- Secure fire 2,0 tommer huskonstruktion stænger til forsiden af spejlet mount
- Sikker to 2,0 tommer huskonstruktion stænger diagonalt på højre side af buret terning.
- Slut retvinklet spejl mount montage på venstre side af 1,0 tommer bur plade / linse rør samling ved at placere de modstående bur montage stænger gennem de respektive åbninger af 30 mm bur plade.
- Tråd en z-akse oversættelse montere gennem 3,0 tommer bur montage stænger på højre side af enheden.
- Vedhæft en 10X akromatisk objektiv linse til z-aksen oversættelse mount.
- Byg en 1,0 tommer fiber adapterplade / xy-akse oversættelse objektivfatning forsamling.
- Få en xy-akse oversættelse mount og en 1,0 tommer fiber adapter plade.
- Fastgør 1,0 tommer fiber adapterplade i xy-aksen oversættelse objektivfatningen.
- Slide than 1,0 tommer fiber adapter / xy-akse oversættelse objektivfatning samling foran objektivet.
- Opnå to 0,5 inch lange, 1,0 tommer linse diameter rør, et 440/40 nm båndpasfilter (excitation filter) og et 525/36 nm båndpasfilter (emission filter).
- Placer hvert filter inde i en 0,5 tommer lang, 1,0 tommer linse rørdiameter, så at pilen på ydersiden af filteret modstående side af linsen rør med udvendige gevind.
- Monter filtrene til samlingen.
- Opnå to standard støttemure ringe.
- Fastgør filtrene inde i 0,5 tommer lange, 1,0 tommer linse diameter rør med standard støttemure ringe.
- Skrues linsen rør med excitationsfiltret til forsiden af 30 mm buret terning og skrue i linsen rør med emission filter til retvinklet spejl mount.
- Skru 0,5 tommer linse rør med emission filter på forsiden af retvinklet spejl mount.
- obtain to 1,0 tommer gevind 30 mm bur plader og placere dem foran de 0,5 tomme lang, linse diameter 1,0 tommer rør indeholdende filtrene.
- Brug epoxy eller stærk lim, vedhæfte en 455 nm LED til buret plade forbundet til excitation filter.
- Opnå en 0,5 inch lange, 1,0 tommer linse diameter rør og et 1,0 inches akromatisk dublet rør linse med brændvidde på 50 mm.
- Glasset anbringes linsen inde i objektivet røret, således at pilen på ydersiden af linsen vender den side af linsen rør med de udvendige gevind.
- Skru røret linse til samlingen.
- Opnå en standard låsering.
- Fastgør linsen inde i 0,5 tommer lang, 1,0 tommer linse diameter rør med standard låseringen.
- Fastgør objektivet rør med røret linsen til den længst til venstre bur plade.
- Placer en 30 mm bur plade foran den 0,5 tommer lang, 1,0 inches i diameter linse røret med rør linse.
- Vedhæft en stress fri holdering til indersiden af den 30 mm bur plade.
- Vedhæft en USB monokromt kamera til buret plade med stress fri låsering.
- Konstruér de optiske indlæg montageindretninger.
- Opnå fire 0,5 tommer stillingsindehavere, fire 0,5 tommer optiske indlæg, og fire montering baser.
- Fastgør 0,5 tommer optiske indlæg inde i 0,5 tommer stillingsindehavere.
- Fastgør 0,5 tommer stillingsindehavere på de voksende baser.
- Skru de fire optisk indlæg montering enheder til skruehullerne placeret under 30 mm bur terning, højre vinkel spejl mount, buret plade forbundet til LED, og buret plade tilsluttet kameraet.
- Skru de fire den optiske indlæg montering enheder til enten et optisk breadboard eller optisk bord for at afslutte opførelsen af den høje opløsning fluorescens microendoscopy modalitet.
ftp_upload / 54.564 / 54564fig2.jpg "/>
Figur 2:. Montering af den høje opløsning fluorescens microendoscopy modalitet med høj opløsning fluorescens microendoscopy modalitet kan konstrueres ved at bygge en skal af komponenter diameter størrelse 1,0 tommer, med særlig omhu ved håndtering af dichroic spejl, objektiv, excitation / emission filtre og rør linse. Glas overflader af disse komponenter skal nøje håndteres ved hjælp af linse papir. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Montering af Sub-diffus reflektans spektroskopi Modalitet
Bemærk: kan visualiseres De skitserede trin til montering af sub-diffus reflektans spektroskopi modalitet i figur 3.
- Anskaf en wolfram-halogen lyskilde og ved hjælp af epoxy eller en stærk lim, sikre en 1,0 tommer threaded 30 mm bur plade på forsiden.
- Secure fire 3,0 tommer huskonstruktion stænger til buret plade.
- Vedhæft en z-akse oversættelse mount til bur samling stænger.
- Skru en 20X akromatisk objektiv linse til z-aksen oversættelse montere.
- Byg en fiber adapterplade / xy-akse oversættelse objektivfatning forsamling.
- Få en xy-akse oversættelse mount og en 1,0 inches fiber adapter plade.
- Fastgør fiber adapterplade i xy-aksen oversættelse objektivfatningen.
- Skub 1,0 tommer fiber adapter / xy-oversættelse mount montage foran objektivet.
- Byg motoren arm forsamling.
- Anskaf specialbyggede aluminium motor arm og en SMA fiber adapter plade.
- Skrue i fiberen adapterpladen (med udvendigt gevind) i aluminium motor arm (med indvendigt gevind).
- Fastgør specialbyggede aluminium motor arm adapter til motoren armen med fire # 4-40 0.5 i. Skruer.
- Byg motor / motor arm / motorhus forsamling.
- Anskaf specialbyggede aluminium motorhus og 400-trins stepmotor.
- Line up skruehullerne på stepmotor og motorhuset og fastgør med fire # 4-40 0,5 tommer skruer.
- Feed roterende motor stang af stepmotor gennem åbningen af motoren arm forsamling og stram låseskruen på aluminium motor arm adapter.
- Byg den optiske omskifter forsamling.
- Anskaf specialbyggede aluminium optisk switch og tre 1,0 tommer fiber adapter plader.
- Tråd adapter plader ind i de gevindskårne huller i den optiske omskifter.
- Fastgør specialbyggede aluminium optisk switch face-plade på den optiske switch med fire # 4-40 0,5 tommer skruer.
- Monter motor / motor arm / motorhus forsamling til den optiske omskifter ved at fodre den roterende motor stang af stepmotor gennem det centrale hul than optisk kontakt.
- Få et elektrisk kredsløb og stepmotor driver, og derefter placere stepper motor driver over centrale rille af breadboard.
- Overhold den elektriske forbindelse skematiske (Figur 3, 2,12) for den stepmotor driver, 12 V strømforsyning, og stepmotor.
- Tilslut stepmotor driver, 12 V strømforsyning, og stepmotor som angivet i ledningsdiagram (Figur 3, 2,12) for at færdiggøre opførelsen af den motoriserede optisk switch.
- Skru den optiske skifte komponenter og wolfram-halogen lyskilde til en optisk breadboard eller optisk bord i nærheden af tidligere konstrueret (figur 2, 1,24) høj opløsning fluorescens microendoscopy forsamling.
- Sæt den ene ende af en 550 um, 0,22 NA patch kabel til 1,0 tommer fiber adapterplade motorens arm forsamling.
- Fastgør den anden ende af 550 um, 0,22 NA patch kabel til fiberen forbindeeller af USB-spektrometer.
- Skru de fem distale sonde kabler til de respektive 1,0 tommer fiber adapter plader på instrumenteringen for at afslutte færdiggørelse af den multimodale høj opløsning billedbehandling og sub-diffus reflektans spektroskopi fiber-bundt microendoscope.
- Skru den centrale 1 mm billede diameter fiberkabel til 1,0 tommer fiber adapterplade nævnt i trin 1.9.2.
- Skru den yderste venstre 200 um multimode fiberkabel til 1,0 tommer fiber adapterplade nævnt i trin 2.6.
- Skru i 2. 200 um multimode fiberkabel til den yderste venstre 1,0 tommer fiber adapter knyttet til wolfram-halogenlampe nævnt i trin 2.9.2.
- Skru i 3. 200 um multimode fiberkabel til midten 1,0 tommer fiber adapterplade nævnt i trin 2.9.2.
- Skru de 4 th 200 um multimode fiberkabel til længst til højre 1,0 tommer fiber adapterplade nævnt i trin 2.9.2.
Figur 3:. Montering af sub-diffus reflektans spektroskopi modalitet Den sub-diffus reflektans spektroskopi modalitet kan konstrueres ved hjælp af en grundlæggende wolfram-halogenlampe koblet til en objektiv linse til at fokusere lyset gennem 200 um multimode levering fiber, og et spektrometer. Derudover kan en specialbygget motoriseret optisk switch konstrueres inden lampen-fiber-spektrometer vej til at skifte mellem de enkelte SDS. Efterforskere ved hjælp af flere spektrometre til at erhverve fra flere SDS'er kan omgå den optiske omskifter komponent. Klik her for at se en større version af dette tal.3. Kalibrering af Sub-diffus reflektans spektroskopi Modalitet
Bemærk: following trin (afsnit 3), skal være afsluttet, før spektral dataindsamling (afsnit 4).
- Tænd alle dele af instrumentering, herunder 455 nm LED, bredbånd wolfram-halogenlampe, CMOS kamera, USB spektrometer, stepmotor, og motorprintkortet. Sørg lukkeren på wolfram-halogenlampe er åben.
- Sluk alle omgivende lys.
- Åbn brugerdefinerede datafangst software.
- Hold udstyr kører i 30 minutter for lampen nå frem til en passende temperatur, og for iboende støj fra spektrometer at stabilisere sig.
- Placer en 20% diffus reflektans standard inde i bunden åbning af specialbyggede, 3D trykt kalibrering standard enhed.
- Placer fiberoptiske sonde inde længst til venstre slot på den brugerdefinerede, 3D trykt fiber-holder, demonstreret i figur 4. Den længst til venstre slot løser den vinkelrette afstand fra fiberoptiske sonden til den refleksionsmåleren på 2,1 mm, som er den optimum afstand i hvilken signalet nå spektrometer maksimeres for de første SDS af 374 um.
- Juster motoriseret optisk omskifter til længst til venstre position, således at spektrometer er forbundet til de første SDS af 374 um.
- Indstil integrationstiden til 500 msek. Denne integration gang skal vælges for ikke at mætte spektrometer, men opretholde en praktisk lav integration tid.
- Anskaf et spektrum, R max, 374μm, ved at klikke på "Acquire Spectrum" i softwaren.
- Luk lukkeren på wolfram-halogenlampe og optage et spektrum, R mørke, 374μm, baggrundsstøj, ved at klikke på "Acquire Spectrum" i softwaren. Når der er opnået åbne lukkeren igen.
- Placer fiberoptiske sonde inde længst til højre slot af den brugerdefinerede, 3D trykt fiber-holder, demonstreret i figur 4. Den længst til højre slot løser den vinkelrette afstand fra fiber-optic sonden til den refleksionsmåleren på 3,9 mm, hvilket er den optimale afstand, hvor signalet nå spektrometer maksimeres for anden SDS på 730 um.
- Juster motoriseret optisk kontakt til den midterste position, således at spektrometer er forbundet med den anden SDS af 730 um.
- Anskaf et spektrum, R max, 730μm, ved at klikke på "Acquire Spectrum" i softwaren.
- Luk lukkeren på wolfram-halogenlampe og optage et spektrum, R mørke, 730μm, baggrundsstøj, ved at klikke på "Acquire Spectrum" i softwaren.
- Åbn lukkeren igen.
Figur 4:. Kalibrering af sub-diffus reflektans spektroskopi modalitet For pre-eksperimentel kalibrering, skal det fiberoptiske sonde spids placeres på forskelligevinkelrette afstande fra 20% diffus reflektans standard afhængigt af SDS. Til konsekvent opnå disse vinkelrette afstande på tværs af alle forsøg blev en kalibreringsstandard anordning (enhed tværsnit vist i (a)) for at holde sonden på nøjagtige afstande fra 20% diffus reflektans standard. I dette specifikke fiberoptisk probe setup, er lys fra wolfram-halogenlampe vist gennem den optiske omskifter ved kilden-detektor adskillelser af (b) 374 um og (c) 730 um (med motor og motor arm fjernes fra den optiske bane for tydelighedens skyld). Afstande af (d) 2,1 mm for 374 um SDS, og (e) 3,9 mm for der kræves de 730 um SDS til kalibrering. Klik her for at se en større version af dette tal.4. In vivo data Acquisition og optisk Property Udsugning fra menneskehud
I dette afsnit vil det multimodale microendoscope teknik demonstreres på in vivo menneskehud.
- Åbn brugerdefinerede datafangst software og juster spektrometer integration tid ved at klikke på "Integration Time" og sæt den, så den er den samme som under kalibreringen, hvilket var 500 msek i denne sag (trin 3.8).
- Bestem område af huden til at erhverve data, som kan afvige om anvendelsen af investigator. I dette tilfælde blev den tynde hud på underarmen valgt som en demonstration.
- Hvis huden område indeholder hår, fjerne hår med en disponibel sterilt barbermaskine.
- Anskaf en standard gul overstregningstusch, som indeholder pyranin blæk, og let markere det valgte hudområde.
- Tænd for 455 nm LED og lukke lukkeren til wolfram-halogenlampe.
- Placer sonden i blide berøring med huden.
- Flyt proben enrundt på de farvede område af væv for at se en levende høj opløsning feed af apikal keratinocyt arkitektur på tegnevinduet af softwaren.
- Vælg en passende eksponeringstid og gevinst, 150 ms og 10 dB forstærkning i dette tilfælde, for at undgå billede mætning, ved at klikke på "Exposure Time" og "Gain", skrive i de relevante værdier, og derefter klikke på "Anvend indstillinger" i softwaren grænseflade.
- Anskaf et billede ved at klikke på "Hent billede" i software interface.
- Mens du holder sonden på det samme billede site, slukke for 455 nm LED og åbne lukkeren til wolfram-halogenlampe.
- Juster motoriseret optisk omskifter i venstre position, således at spektrometer er forbundet med den anden SDS af 374 um.
- Acquire spektre, R væv, 374μm, ved at klikke på "Acquire Spectra" i software interface.
- Juster motoriserede optisk skifte til midterpositionen sådanne thpå spektrometeret er forbundet med den anden SDS af 730 um.
- Acquire spektre, R væv, 730μm, ved at klikke på "Acquire Spectra" i software interface.
- Åbn tilpassede efterbehandling software.
- Kør efterbehandling software ved at klikke på "Kør" og vælg den høje opløsning fluorescens billede, fire kalibrering spektre, og de to in vivo-spektre fra den mappe, hvor data blev gemt, når du bliver bedt om af softwaren.
BEMÆRK: brugerdefineret software opnår den sande absolutte reflektans (R abs, 374μm og R abs, 730μm) ved hjælp af følgende ligninger.
Den efterbehandling kode, som tidligere beskrevet, beregner en tilpassede kurve til den diffuse reflektans spektre (ligningerne 1 og 2) og derefter determines væv fysiologiske parametre, herunder ([Hb], [Mel], og São 2). 11,22,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter denne protokol, vil forskeren indhente en in-fokus billedet i høj opløsning af vævsstedet med fuld synsfelt (figur 5). Omridset af celler kan ses, hvis farves med pyranin blæk fra en standard gul overstregningstusch, mens enkelte cellekerner kan ses, hvis farves med et farvestof, såsom proflavin. Efter spektral erhvervelse, den efterbehandling software bruger a priori viden om in vivo hæmoglobinkoncentration ([Hb]) og melanin koncentrationer ([Mel]) 21 til at passe til sub-diffus reflektans spektre og bestemme værdier for [Hb], [Mel ], og væv iltmætning (SAO 2) som vist i figur 5. Den efterbehandling software anvender brede fysiologiske grænser ([Hb] = 0-150 mg / ml, [Mel] = 0-30 mg / ml, og SAO 2 = 0-100%) til at passe den kalibrerede spektre. 21
Figur 5:. Co-registrering kvalitative og kvantitative data fra in vivo human normal hud og en godartet Melanocytære Nævi En høj opløsning fluorescens billede blev taget fra en pyranin-blæk (fra en standard gul overstregningstusch) farves godartet Melanocytære Nævi og tilstødende normal hud væv med en eksponeringstid på 150 msek. Omridset af keratinocytter kan ses tydeligt i begge billeder. Den normale hud vævssted og Melanocytære Nævi havde hæmoglobin koncentrationer på 1,63 og 0,86 mg / ml, melanin koncentrationer på 0,78 og 10,20 mg / ml, med lignende oxygenmætninger af 99%. Denne figur viser fordelen ved co-registrering kvalitativ strukturelle og kvantitativ funktionel information. Klik her for at se et større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den multimodale høj opløsning billedbehandling og sub-diffus reflektans spektroskopi fiber-bundt microendoscope rapporteret her kan optimeres og anvendes af efterforskere til en lang række applikationer, herunder endoskopisk eller håndholdt brug for mennesker eller dyreforsøg. Det giver således en fleksibel metode til at visualisere in vivo apikal væv mikro-arkitektur sammen målinger af hæmoglobinkoncentrationen, melanin koncentration og væv iltmætning fra to forskellige væv dybder. Denne artikel beskriver specifikationerne for fiberoptiske sonde, skitseret en protokol til samling af høj opløsning imaging system og sub-diffus reflektans imaging system, og vist dens anvendelse i humane væv in vivo, ved hjælp pyranin blæk som fluorescerende kontrastmiddel til væv visualisering. Lignende farver, såsom proflavin eller fluorescein, kan anvendes i stedet for pyranin blæk med passende godkendelse. 4-7,11
"> Enhver sonde funktion kan ændres fra dette design. For høj opløsning fluorescens microendoscopy modalitet, den 1 mm billedet diameter fiber bestod af 50.000 individuelle kerne fibre med 4,5 um afstand, hvilket resulterer i en konstant sub-cellulære rumlig opløsning på 4,5 um . Efterforskere ønsker en anden størrelse billede fiber for at opnå en større eller mindre field-of-view kan finde disse billedfiler fibre let tilgængelige med diametre mellem 0,14 og 1,40 mm. en tube linse med brændvidde på 50 mm blev valgt således, at CMOS-sensoren fanget den fulde 1 mm field-of-view fra billedet fiber. Når du opbevarer objektivlinsen konstant, øger brændvidden af røret linse vil øge forstørrelse og sampling frekvens, men formindske field-of-view. 11 således forstørrelsen af objektivlinsen, brændvidde af røret linse, størrelsen af billedsensoren, og størrelsen af billedet fiber kan og bør optimeres afhængigt af behov. Endelig filtre og excitationslyskilde kan modificeres afhængigt af excitation / emission spektre af fluorescerende farvestoffer. 4-7 Ud over at modificere proben og høj opløsning fluorescens microendoscopy instrumentering, kan sub-diffus reflektans spektroskopi instrumentering ændres.For sub-diffus reflektans spektroskopi modalitet, kan forskellige størrelse multimode fibre bruges på hver SDS. Mindre multimode diameter fibre vil være i stand til at levere og indsamle lys over et mindre område, men det anbefales at bruge et array af identisk fordelte fibre at øge signal-støj, hvis der anvendes fiberdiametre mindre end 200 um. Efterforskere analysere hud eller oralt væv kan drage fordel af en samlet større sonde til at øge field-of-view og signal-støj, men i snævrere lysende organer, såsom spiserøret eller mave-tarmkanalen, efterforskere vil stå tilføjet begrænsninger vedrørende sonde størrelse, især for kompatibilitet med biopsi havn klosterional endoskoper. 8 Andre spektroskopi komponenter, der kan ændres på, er bredbånd lyskilde og motoriseret optisk switch. En wolfram-halogenlampe blev valgt i denne sag, selv om andre lyskilder kan og er blevet anvendt i andre undersøgelser, herunder xenonbuelamper og lysdioder, hvilket kan øge signal-støj og lavere integration gange. 2,15,20 Den motoriseret optisk switch præsenteres her blev specialbygget til at håndtere op til tre sikkerhedsdatablade, men kan ændres til at omfatte flere eller færre indgange. Det skal bemærkes, at den motoriserede optisk kontakt tilføjer et ekstra optisk komponent mellem bredbånd lyskilde og spektrometer, aftagende signal-til-støj. Kontakten kan ikke være nødvendigt for efterforskerne med flere spektrometre, der erhverver data samtidigt, men inklusive en optisk switch komponent reducerer i sidste ende instrumentering omkostninger med ca. $ 3.000 USD pr SDS.
Konstruktion af instrumentering (
Med hensyn til fejlfinding, spektre resulterer i dårlige anfald (gennemsnitprocent fejl større end 10% mellem rådata og monteret data) vil give upålidelige værdier for de tre væv fysiologiske parametre ([Hb], [Mel], og São 2) præsenteres her. Dårlige passer er mest sandsynligt et resultat af enten bevægelse mellem sonden og hudområdet under dataopsamling, smalle randbetingelser i efterbehandling kode, eller upålidelige a priori værdier af [Hb] og [Mel]. 11,21,24, 26 Forbedringer i disse tre almindelige fejl forekomster bør fastsætte den præcise montering af sub-diffus reflektans spektre. Således kan dataindsamlingen forbedres ved at reducere spektrometer integrationstid at reducere bevægelsesartefakter inden spektrene. Derudover randbetingelser repræsenterer antallet af mulige beregningsmæssige output værdier for [Hb], [Mel], og São 2 efter efterbehandling. I disse undersøgelser randbetingelser var 0-10 mg / ml for [Hb], 21,22 0-40 mg / ml for [Mel], 27,28 og 0-100% for Sao 2,
Den primære begrænsning for dette multimodal billeddannelse og spektroskopi fiber-bundle microendoscopy platform er manglen på en Vidvinklet afbildningsmodalitet. Høj opløsning fluorescens microendoscopy modalitet har en cirkulær field-of-view, der er 1 mm i diameter, hvilket gør det vanskeligt hurtigt at scanne et stort område af væv. En beregningsmetode til at overvinde denne begrænsning er billede mosaIcking, at en teknik, der anvendes give et bredere felt-of-view ved at stable tilstødende mikro-skala billeder i en enkelt, større billede kort. 10. En sådan billede billedmosaik er tidligere blevet påvist af Prieto et al. at undersøge colon billede funktioner. 10. En instrumentering modifikation at overvinde denne begrænsning ville være at gøre proben forenelig med biopsi havn i en konventionel endoskop, såsom det præsenteres af Parikh et al probe. at undersøge kolorektal neoplasi. 8 denne funktion kombinerer fordelene ved et bredt felt-of-view med mikro-skala billeddannelse af høj opløsning fluorescens microendoscopy. 8
Samlet set blev denne teknik demonstreret på in vivo menneskehud og viser værdien af co-registrering med høj opløsning væv mikro-arkitektoniske billeder med den underliggende melanin koncentration, hæmoglobinkoncentrationen, og væv iltmætning (figur 5). Denne technique kan bruges af forskere, der ønsker at undersøge sammenhængen mellem strukturelle og funktionelle abnormiteter væv in vivo, eller analysere væv funktionelle ændringer i mangel af observerbare strukturændringer. Fremtidige undersøgelser vil undersøge levedygtigheden af denne teknik i forskellige epitel sygdomstilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
