Meting van<em> In Vitro</em> Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

HIV-1 envelopeiwitten aangrijpen verwante receptoren op het doelceloppervlak, waardoor virale celmembraan fusie gevolgd door de afgifte van het virale capside (CA) kern in het cytoplasma. Vervolgens het virale reverse transcriptase (RT), als onderdeel van een gelijknamige nucleoproteïne complex genaamd de Reverse Transcriptie Complex (RTC), zet het virale enkelstrengs RNA genoom in een dubbelstrengs DNA-kopieën (vDNA). Dit leidt tot de biogenese van andere nucleoproteïne complex, de zogenoemde pre-integratie complex (PIC), bestaande uit vDNA en geassocieerde virus eiwitten en gastheerfactoren. De PIC-geassocieerde virale integrase (IN) orchestrates de integratie van het vDNA in het chromosomale DNA in een tijd en ruimte gereguleerd tweestapswerkwijze. Ten eerste, de IN verwerkt de 3 'einden van het vDNA in het cytoplasma en anderzijds na de PIC traffics naar de kern, bemiddelt integratie van de verwerkte vDNA in het chromosomale DNA. De zuivere intercommunales geïsoleerdvan doelcellen acuut geïnfecteerd met HIV-1 zijn functioneel in vitro, aangezien zij bevoegd om de bijbehorende vDNA integreren in een heteroloog exogeen toegevoegde doelwit DNA. Dergelijke PIC-based in vitro integratie assays hebben aanzienlijk bijgedragen aan de afbakening van de mechanistische details van de retrovirale integratie en tot het ontdekken van IN-remmers. In dit rapport gaan we dieper in op een bijgewerkte HIV-1 PIC test die een geneste real-time kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR) gebaseerde strategie hanteert voor het meten van de in vitro integratie activiteit van geïsoleerde inheemse foto's.

Introduction

HIV-1 replicatie in de doelcel omvat meerdere stappen, lijnen ingedeeld in twee fasen: vroege en late events. De vroege gebeurtenissen beginnen als HIV-1 sequentieel aan het doelwit bindt celoppervlak receptor CD4 en één van de twee co-receptoren (CCR5 of CXCR4) ^1. Bijgevolg is de virus-celmembranen zekering en het virale capside (CA) kern vrij in het cytoplasma ^2. De CA kern bevat het virale genoom enkelstrengs RNA (ssRNA) en verscheidene eiwitten, zowel virale als cellulaire oorsprong. De CA-geassocieerde virale eiwitten omvatten Reverse Transcriptase (RT) en integrase (IN), twee enzymen die kritische stappen bemiddelen tijdens vroege gebeurtenissen in de virale replicatie. De RT en IN functie in de context van nucleoproteïne complexen, namelijk de reverse transcriptie complex (RTC) en het pre-integratie complex (PIC), respectievelijk ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. De uiteinden van het virale genoom ssRNA haven terminal repeat (R) elementen naast de unieke sequenties U5 (aan het 5 'uiteinde) en U3 (aan het 3' uiteinde). De RTC zet de virale ssRNA genoom in een dubbelstrengs (ds) DNA-kopie (vDNA). Dit reverse transcriptieproces leidt ook tot verdubbeling van de U5 en U3 sequenties, waardoor het genereren van lange terminale herhalingen (LTR) aan beide uiteinden van het vDNA ^{7, 8.} Vervolgens de PIC-geassocieerde IN katalyseert twee opeenvolgende biochemische reacties die de integratie van het vDNA mogelijk in het gastheer chromosoom ^{9, 10, 11.} Eerst, in het cytoplasma, IN multimeren grijpen zowel LTR ¹² en klieven een dinucleotide van elk van de 3'-uiteinden. Deze 3'-end verwerking genereert een hydroxylgroep aan beide 3'-uiteinde (CA _OH) van het vDNA.Vervolgens PIC traffics naar de kern, waarbij in gebruik het vDNA CA _OH als nucleofiel op beide strengen van het chromosomale DNA geknipt in een versprongen wijze. Tegelijkertijd IN splits gecoördineerd beide uiteinden van het vDNA de resulterende fosfodiesterbindingen op tegenoverliggende strengen van het chromosomale DNA. Na deze strand transfer stap, de gastheercelmachinerie verwijdert de twee ongepaarde nucleotiden aan de 5 'einden van het vDNA en herstelt de daaropvolgende enkelstrengige openingen op de kruising van de integratieplaats. De vroege gebeurtenissen dus culmineren met de oprichting van een geïntegreerde DNA-kopie (provirus) van het HIV-1-genoom. Het provirus verschaft een geschikte omgeving voor efficiënte virale genexpressie, welke latere gebeurtenissen, zoals de expressie van het virus gecodeerde eiwitten initieert; assemblage van de onrijpe virus; en ontluikende, release, en rijping tot infectieuze virions ^13.

Gezuiverd recombinant retrovirale IN bevoegd isuit te voeren, in vitro, zowel 3'-end verwerking en strand transfer activiteiten op exogeen geleverd LTR-achtige substraat DNA. Biochemische studies met dergelijke gezuiverde recombinant IN zijn kritische aspecten van vDNA integratie ^{14, 15, 16, 17} geopenbaard. Anders dan in natuurlijke infectie, het in vitro biochemische reactie ondersteunt onderling integratie van beide uiteinden van het substraat DNA in het doelwit DNA. Daarentegen retrovirale PICs geïsoleerd uit acuut geïnfecteerde cellen eensgezind beide uiteinden van de endogene vDNA integreren heterologe doelwit DNA. Dit leidde tot de wijdverbreide invoering en daaropvolgende verfijningen van I n Vitro Integratie (IVI) testen met behulp van geïsoleerde inheemse zuivere intercommunales.

In de eerste gerapporteerde retrovirale IVI assay, cytoplasmatische extracten uit cellen geïnfecteerd met recombinant MuisLeukemie virus (MLV) die het op E. coli supF gen in de LTR aan de grondslag van de activiteit en het DNA van een mutant defectief in lambda faag lytische groei exogeen geleverd als het doelwit DNA. Succesvolle integratie van het recombinante DNA MLV kopiëren in de faag-DNA en de daaruit voortvloeiende supF expressie leidde tot herstel van de-plaque-vormende vermogen van de recombinante fagen. Echter, deze experimentele strategie is arbeidsintensief en maatregelen integratie op een indirecte manier. Dergelijke restricties pakken, een Southern-blot gebaseerde indirecte eindlabeling assay, die de PIC-geassocieerde IVI activiteit als maat voor de endogene vDNA geïntegreerd exogeen gelineariseerde DNA bacteriofaag PhiX174 kwantificeert ontwikkeld ^{6, 7, 18.} Hoewel deze werkwijze een directe maat integratiegebeurtenissen, relatief grote hoeveelheden PIC voorbereiding vereist, die nog een technisch uitdagendetrachten. Om dit te omzeilen, geneste PCR-gebaseerde testen die slechts geringe hoeveelheden PICs ontwikkeld ^{4, 5, 19.}

In dit verslag we een bijgewerkte versie van beschrijven een geneste PCR-gebaseerde in vitro werkwijze ontwikkeld om de HIV-1 PIC-gemedieerde integratie activiteit tijdens natuurlijke infectie recapituleren. Deze methode gebruikt de cytoplasmatische extracten van HIV-1-geïnfecteerde doelcellen als bron van endogene PIC activiteit, gemeten met real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR). De procedures voor het isoleren van zuivere intercommunales en het meten van de integratie activiteiten worden aangepast, met wijzigingen, van protocollen, gepubliceerd door de Engelman laboratorium ^20. In deze werkwijze wordt de PIC-geassocieerde integratie geïnitieerd door een exogeen lineaire doel DNA ²¹ en het DNA verkregen productenDeze integratie reactie worden gezuiverd en gebruikt als uitgangsmateriaal voor daaropvolgende PCR-kwantificering. In de eerste ronde conventionele PCR, wordt het virale DNA-doelwit knooppunten geamplificeerd met gebruikmaking van geschikte primers. In de tweede ronde qPCR, LTR-specifieke primers worden gebruikt om specifiek verrijken vDNA populatie van de eerste ronde PCR producten. Zie het protocol gedeelte voor een gedetailleerde beschrijving van deze methode.

In vitro onderzoeken met retrovirale PICs hebben geleid tot significante vooruitgang in ons begrip van het mechanisme van DNA retrovirale integratie en in de ontwikkeling van remmers in. Op basis van de recent toegenomen aandacht voor het in kaart brengen van HIV-1 integratie sites, het bepalen van de rol van virale en gastheer factoren in HIV-1 integratie en de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen aan de bestrijding van resistentie tegen geneesmiddelen, overwegen we een toenemende belangstelling voor en het wijdverbreide gebruik van IVI assays , zoals die in dit rapport beschreven. Dit op zijn beurt zal leiden tottoekomstige verfijningen in de werkwijze, waardoor de omvang van de toepassingen te diversifiëren.

Protocol

1. virusproductie OPMERKING: Om hoge titers van besmettelijke HIV-1 te genereren, transfecteren de humane embryonale nier (HEK) cellijn 293T met een besmettelijke HIV-1 moleculaire kloon met behulp van een geactiveerde-dendrimeer gebaseerde transfectiereagens. Waargenomen is dat de calciumfosfaat transfectie methode levert vergelijkbare resultaten. In een Biosafety Level 2 (BSL2) lab zaden 3 x 10 6 293T cellen per 10 cm schaal in 8 ml Dulbecco's Modified Eagle Mediu…

Representative Results

Isolatie van HIV-1 PICs Een schema van het protocol voor de isolatie van HIV-1 PICs van acuut geïnfecteerde Sup-T1-cellen is weergegeven in Figuur 1. Dit protocol wordt afgeleid uit de door Engelman et al methoden. 19, 20. HIV-1 PICs zijn nucleoproteïne complexen die zijn samengevoegd geïnfecteerde cellen en omvatten de rev…

Discussion

Biochemische analyses van retrovirale pics kritische inzichten in het mechanisme van retrovirale DNA-integratie. Meting van de activiteit van retrovirale integratie PICs kan door plaquevorming assay, Southern blot-analyse en geneste qPCR. De experimentele strategie van plaque assay is omslachtig en maakt gebruik van een indirecte methode integratie ^{6, 7, 18} te meten. Southern-blot gebaseerde testen maatregel integratie direct m…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862