Summary

Meting van<em> In Vitro</em> Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

Published: February 22, 2017
doi:

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

HIV-1 envelopeiwitten aangrijpen verwante receptoren op het doelceloppervlak, waardoor virale celmembraan fusie gevolgd door de afgifte van het virale capside (CA) kern in het cytoplasma. Vervolgens het virale reverse transcriptase (RT), als onderdeel van een gelijknamige nucleoproteïne complex genaamd de Reverse Transcriptie Complex (RTC), zet het virale enkelstrengs RNA genoom in een dubbelstrengs DNA-kopieën (vDNA). Dit leidt tot de biogenese van andere nucleoproteïne complex, de zogenoemde pre-integratie complex (PIC), bestaande uit vDNA en geassocieerde virus eiwitten en gastheerfactoren. De PIC-geassocieerde virale integrase (IN) orchestrates de integratie van het vDNA in het chromosomale DNA in een tijd en ruimte gereguleerd tweestapswerkwijze. Ten eerste, de IN verwerkt de 3 'einden van het vDNA in het cytoplasma en anderzijds na de PIC traffics naar de kern, bemiddelt integratie van de verwerkte vDNA in het chromosomale DNA. De zuivere intercommunales geïsoleerdvan doelcellen acuut geïnfecteerd met HIV-1 zijn functioneel in vitro, aangezien zij bevoegd om de bijbehorende vDNA integreren in een heteroloog exogeen toegevoegde doelwit DNA. Dergelijke PIC-based in vitro integratie assays hebben aanzienlijk bijgedragen aan de afbakening van de mechanistische details van de retrovirale integratie en tot het ontdekken van IN-remmers. In dit rapport gaan we dieper in op een bijgewerkte HIV-1 PIC test die een geneste real-time kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR) gebaseerde strategie hanteert voor het meten van de in vitro integratie activiteit van geïsoleerde inheemse foto's.

Introduction

HIV-1 replicatie in de doelcel omvat meerdere stappen, lijnen ingedeeld in twee fasen: vroege en late events. De vroege gebeurtenissen beginnen als HIV-1 sequentieel aan het doelwit bindt celoppervlak receptor CD4 en één van de twee co-receptoren (CCR5 of CXCR4) 1. Bijgevolg is de virus-celmembranen zekering en het virale capside (CA) kern vrij in het cytoplasma 2. De CA kern bevat het virale genoom enkelstrengs RNA (ssRNA) en verscheidene eiwitten, zowel virale als cellulaire oorsprong. De CA-geassocieerde virale eiwitten omvatten Reverse Transcriptase (RT) en integrase (IN), twee enzymen die kritische stappen bemiddelen tijdens vroege gebeurtenissen in de virale replicatie. De RT en IN functie in de context van nucleoproteïne complexen, namelijk de reverse transcriptie complex (RTC) en het pre-integratie complex (PIC), respectievelijk 3, 4, 5 <sup>, 6. De uiteinden van het virale genoom ssRNA haven terminal repeat (R) elementen naast de unieke sequenties U5 (aan het 5 'uiteinde) en U3 (aan het 3' uiteinde). De RTC zet de virale ssRNA genoom in een dubbelstrengs (ds) DNA-kopie (vDNA). Dit reverse transcriptieproces leidt ook tot verdubbeling van de U5 en U3 sequenties, waardoor het genereren van lange terminale herhalingen (LTR) aan beide uiteinden van het vDNA 7, 8. Vervolgens de PIC-geassocieerde IN katalyseert twee opeenvolgende biochemische reacties die de integratie van het vDNA mogelijk in het gastheer chromosoom 9, 10, 11. Eerst, in het cytoplasma, IN multimeren grijpen zowel LTR 12 en klieven een dinucleotide van elk van de 3'-uiteinden. Deze 3'-end verwerking genereert een hydroxylgroep aan beide 3'-uiteinde (CA OH) van het vDNA.Vervolgens PIC traffics naar de kern, waarbij in gebruik het vDNA CA OH als nucleofiel op beide strengen van het chromosomale DNA geknipt in een versprongen wijze. Tegelijkertijd IN splits gecoördineerd beide uiteinden van het vDNA de resulterende fosfodiesterbindingen op tegenoverliggende strengen van het chromosomale DNA. Na deze strand transfer stap, de gastheercelmachinerie verwijdert de twee ongepaarde nucleotiden aan de 5 'einden van het vDNA en herstelt de daaropvolgende enkelstrengige openingen op de kruising van de integratieplaats. De vroege gebeurtenissen dus culmineren met de oprichting van een geïntegreerde DNA-kopie (provirus) van het HIV-1-genoom. Het provirus verschaft een geschikte omgeving voor efficiënte virale genexpressie, welke latere gebeurtenissen, zoals de expressie van het virus gecodeerde eiwitten initieert; assemblage van de onrijpe virus; en ontluikende, release, en rijping tot infectieuze virions 13.

Gezuiverd recombinant retrovirale IN bevoegd isuit te voeren, in vitro, zowel 3'-end verwerking en strand transfer activiteiten op exogeen geleverd LTR-achtige substraat DNA. Biochemische studies met dergelijke gezuiverde recombinant IN zijn kritische aspecten van vDNA integratie 14, 15, 16, 17 geopenbaard. Anders dan in natuurlijke infectie, het in vitro biochemische reactie ondersteunt onderling integratie van beide uiteinden van het substraat DNA in het doelwit DNA. Daarentegen retrovirale PICs geïsoleerd uit acuut geïnfecteerde cellen eensgezind beide uiteinden van de endogene vDNA integreren heterologe doelwit DNA. Dit leidde tot de wijdverbreide invoering en daaropvolgende verfijningen van I n Vitro Integratie (IVI) testen met behulp van geïsoleerde inheemse zuivere intercommunales.

In de eerste gerapporteerde retrovirale IVI assay, cytoplasmatische extracten uit cellen geïnfecteerd met recombinant MuisLeukemie virus (MLV) die het op E. coli supF gen in de LTR aan de grondslag van de activiteit en het DNA van een mutant defectief in lambda faag lytische groei exogeen geleverd als het doelwit DNA. Succesvolle integratie van het recombinante DNA MLV kopiëren in de faag-DNA en de daaruit voortvloeiende supF expressie leidde tot herstel van de-plaque-vormende vermogen van de recombinante fagen. Echter, deze experimentele strategie is arbeidsintensief en maatregelen integratie op een indirecte manier. Dergelijke restricties pakken, een Southern-blot gebaseerde indirecte eindlabeling assay, die de PIC-geassocieerde IVI activiteit als maat voor de endogene vDNA geïntegreerd exogeen gelineariseerde DNA bacteriofaag PhiX174 kwantificeert ontwikkeld 6, 7, 18. Hoewel deze werkwijze een directe maat integratiegebeurtenissen, relatief grote hoeveelheden PIC voorbereiding vereist, die nog een technisch uitdagendetrachten. Om dit te omzeilen, geneste PCR-gebaseerde testen die slechts geringe hoeveelheden PICs ontwikkeld 4, 5, 19.

In dit verslag we een bijgewerkte versie van beschrijven een geneste PCR-gebaseerde in vitro werkwijze ontwikkeld om de HIV-1 PIC-gemedieerde integratie activiteit tijdens natuurlijke infectie recapituleren. Deze methode gebruikt de cytoplasmatische extracten van HIV-1-geïnfecteerde doelcellen als bron van endogene PIC activiteit, gemeten met real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR). De procedures voor het isoleren van zuivere intercommunales en het meten van de integratie activiteiten worden aangepast, met wijzigingen, van protocollen, gepubliceerd door de Engelman laboratorium 20. In deze werkwijze wordt de PIC-geassocieerde integratie geïnitieerd door een exogeen lineaire doel DNA 21 en het DNA verkregen productenDeze integratie reactie worden gezuiverd en gebruikt als uitgangsmateriaal voor daaropvolgende PCR-kwantificering. In de eerste ronde conventionele PCR, wordt het virale DNA-doelwit knooppunten geamplificeerd met gebruikmaking van geschikte primers. In de tweede ronde qPCR, LTR-specifieke primers worden gebruikt om specifiek verrijken vDNA populatie van de eerste ronde PCR producten. Zie het protocol gedeelte voor een gedetailleerde beschrijving van deze methode.

In vitro onderzoeken met retrovirale PICs hebben geleid tot significante vooruitgang in ons begrip van het mechanisme van DNA retrovirale integratie en in de ontwikkeling van remmers in. Op basis van de recent toegenomen aandacht voor het in kaart brengen van HIV-1 integratie sites, het bepalen van de rol van virale en gastheer factoren in HIV-1 integratie en de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen aan de bestrijding van resistentie tegen geneesmiddelen, overwegen we een toenemende belangstelling voor en het wijdverbreide gebruik van IVI assays , zoals die in dit rapport beschreven. Dit op zijn beurt zal leiden tottoekomstige verfijningen in de werkwijze, waardoor de omvang van de toepassingen te diversifiëren.

Protocol

1. virusproductie OPMERKING: Om hoge titers van besmettelijke HIV-1 te genereren, transfecteren de humane embryonale nier (HEK) cellijn 293T met een besmettelijke HIV-1 moleculaire kloon met behulp van een geactiveerde-dendrimeer gebaseerde transfectiereagens. Waargenomen is dat de calciumfosfaat transfectie methode levert vergelijkbare resultaten. In een Biosafety Level 2 (BSL2) lab zaden 3 x 10 6 293T cellen per 10 cm schaal in 8 ml Dulbecco's Modified Eagle Mediu…

Representative Results

Isolatie van HIV-1 PICs Een schema van het protocol voor de isolatie van HIV-1 PICs van acuut geïnfecteerde Sup-T1-cellen is weergegeven in Figuur 1. Dit protocol wordt afgeleid uit de door Engelman et al methoden. 19, 20. HIV-1 PICs zijn nucleoproteïne complexen die zijn samengevoegd geïnfecteerde cellen en omvatten de rev…

Discussion

Biochemische analyses van retrovirale pics kritische inzichten in het mechanisme van retrovirale DNA-integratie. Meting van de activiteit van retrovirale integratie PICs kan door plaquevorming assay, Southern blot-analyse en geneste qPCR. De experimentele strategie van plaque assay is omslachtig en maakt gebruik van een indirecte methode integratie 6, 7, 18 te meten. Southern-blot gebaseerde testen maatregel integratie direct m…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt mede ondersteund door subsidies DA024558, DA30896, DA033892 en DA021471 van de NIDA / NIH op CD. We hebben ook de RCMI subsidie ​​G12MD007586 erkennen, de Vanderbilt CTSA verlenen UL1RR024975, de Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA subsidie ​​U54 RR026140 van de NCRR / NIH, de U54 subsidie ​​MD007593 uit de NIMHD / NIH, en de Tennessee CFAR subsidie ​​P30 AI110527.

Materials

Fetal bovine serum (FBS)

GIBCO/Invitrogen

10437-028

Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)

GIBCO/Invitrogen

10438-026

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)

GIBCO/Invitrogen

11995-065

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium

GIBCO/Invitrogen

11875-093

Phosphate buffered saline (PBS) (1X)

GIBCO/Invitrogen

20012-027

Trypsin-EDTA (0.25%)

GIBCO/Invitrogen

25200-056

Penicillin-Streptomycin solution (100x)

Cellgro/Mediatech

30-002-CI

HEK293T cells (293T)

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-3216

HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

114

PolyFect transfection reagent

Qiagen

301107

DNase

Calbiochem/Merckmillipore

260913

Immulon 2HB 96-well plates

Thermo Scientific

3455

Triton X-100

Sigma-Aldrich

T9284

ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

1513

ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)

Donor bovine serum

 Gibco/Invitrogen

16030074

Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.

Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.

Recombinant p24 protein

(Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)

Dr. Wesley Sundquist

HIV IgG

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

3957

Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate

Pierce/ThermoFisher

31412

TMB Microwell Peroxidase substrate system

KPL, Inc.

50-76-00

SupT1 cells

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-1942

HEPES pH 7.2-7.5

(ready-to-use solution)

GIBCO/Invitrogen

15630-080

Potassium chloride (KCl) solution

Sigma-Aldrich

60142

Magnesium chloride (MgCl2) solution

Sigma-Aldrich

M1028

Dithiothreitol (DTT)

Sigma-Aldrich

43815

Aprotinin

Sigma-Aldrich

A6106

Digitonin

Sigma-Aldrich

D141

RNase A

Invitrogen

12091-021

Sucrose

Sigma-Aldrich

S0389

phiX174 Replicative Form 1 DNA

Promega

D1531

PhiX174-F primer:

5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’

PhiX174-R primer:

5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

dNTP mix

Promega

U1515

Go Taq DNA Polymerase

Promega

M3005

Qiaquick gel extraction kit

Qiagen

28706

Ultrapure distilled water

Invitrogen

10977-015

Tris-EDTA (TE) buffer (100X)

Sigma-Aldrich

T9285

Sodium dodecyl sulphate (SDS)

Sigma-Aldrich

L3771

Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0

Sigma-Aldrich

E7889

Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)

Qiagen

19131

Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)

Sigma-Aldrich

P4557

Chloroform

Sigma-Aldrich

288306

Glycogen (5 mg/ml solution)

Ambion/Invitrogen

AM9510

Sodium acetate (3M, pH 5.2)

Sigma-Aldrich

57899

Ethanol

Sigma-Aldrich

E7023

First round LTR primer:

5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’)

First round phiX174 primer:

5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

Second round LTR-R primer:

5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’

Second round LTR-U primer:

5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’;

Second round Taqman probe:

 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC

CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

iQ Supermix

Bio-Rad

170-8862

Riferimenti

  1. Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
  2. Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
  3. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
  4. Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
  5. Hansen, M. S., Smith, G. J., Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
  6. Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
  7. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
  8. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
  9. Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration–mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
  10. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  11. Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
  12. Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
  13. Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
  14. Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
  15. Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
  16. Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
  17. Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
  18. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
  19. Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
  20. Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
  21. Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
  22. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).

Play Video

Citazione di questo articolo
Balasubramaniam, M., Davids, B., Addai, A. B., Pandhare, J., Dash, C. Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes. J. Vis. Exp. (120), e54581, doi:10.3791/54581 (2017).

View Video