Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
Metastase naar secundaire plaatsen, zoals de longen, lever en botten is een traumatische gebeurtenis met een sterftecijfer van ongeveer 90% 1. Van deze sites, de longen is het moeilijkst te bepalen middels intravitale optische beeldvorming door zijn afgesloten plaats binnen het lichaam, delicate aard en belangrijke rol bij het instandhouden juiste fysiologie. Hoewel klinische modaliteiten (positron emissie tomografie (PET), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en computertomografie (CT)) staat om invasieve afbeeldingen van dit weefsel zijn, missen zij de resolutie nodig zijn om de eerste zaaien te visualiseren met een enkele pixel bestaande uit bijna duizend cellen. Huidige modellen van uitgezaaide longkanker zaaien postulaat dat de gebeurtenissen vlak na aankomst een tumorcel zijn deterministische om te overleven en de verdere groei. Dit betekent dat real-time imaging intravitale gereedschappen met enkele cel resolutie 2 nodig om de fenotypen van het zaaien cel definiërenls en test deze modellen. Terwijl hoge resolutie optische beeldvorming van de longen werd uitgevoerd met behulp van verschillende ex vivo preparaten, deze experimenten zijn typisch één tijdpunt assays en zijn gevoelig voor artefacten en eventuele verkeerde conclusies vanwege de drastisch veranderde omgeving (temperatuur, overvloed, cytokines, etc. ) als gevolg van verwijdering uit de borstholte en de bloedsomloop 3. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de time-lapse intravitale optische beeldvorming van het intacte long is mogelijk met een gestabiliseerde onderdruk beeldvormende venster 2,4,5 hebben echter typische belichtingstijden beperkt tot ongeveer 6 uur. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van langdurige intravitale time-lapse beeldvorming van de long gebruikmaking dergelijk venster over een periode van 12 uur. De time-lapse beeldreeksen zo verkregen inschakelen visualisatie en kwantificering van cel-cel interacties, membraan dynamiek en vasculaire perfusie in de longen. Verder hebben we dEscribe een beeld verwerkingstechniek waarbij een ongekend duidelijk beeld van de long microvasculatuur geeft.
Introduction
Hoge resolutie intravitale optische beeldvorming heeft bewezen cruciaal voor het begrijpen van vele biologische processen, waardoor eencellige en sub-cellulaire parameters worden gemeten en gekwantificeerd worden. In kankeronderzoek is intravitale beeldvorming van tumor en stromale cellen leidde tot de identificatie van verschillende micro-omgeving interacties 6-11 die alleen aanwezig in het intacte dier.
Ontdekkingen over micro-omgevingen in verband met intravasation en de verspreiding van tumorcellen bij borstkanker met behulp van één enkele resolutie cell optische beeldvorming in vivo heeft zelfs geleid tot nieuwe markers voor prognose en respons op de behandeling bij borstkankerpatiënten 12-16. De beste imaging technologieën die beschikbaar zijn voor het bekijken van diep van binnen intact interne vitale organen zijn de klinische modaliteiten (MRI, PET, CT), die een prachtig uitzicht op het gehele orgaan te bieden en kunnen pathologieën openbaren nog voordat ze de klinische symptomen te produceren. Ze zijn niet in staat, hHof toevoegde, de vroegste stadia van metastase en de cellulaire mechanismen die progressie van de tumor te onthullen te wijten aan hun gebrek aan enkele resolutie cel. Tegen de tijd longmetastasen zichtbaar in deze modaliteiten, zijn ze goed ingeburgerd en prolifererende. Aangezien de schatting dat 90% van uitgezaaide tumorcellen die aankomen aan de long ofwel niet overleven 17 of aanvankelijk slapend blijven 18, en de waarneming dat ze veel eerder dan verwacht 19, het afbeelden van de eerste stappen van aankomst en overleving komen wordt cruciaal inzicht in het proces van gemetastaseerd zaaien en herhaling van tumorgroei op afgelegen plaatsen.
Het uitvoeren van deze waarnemingen in de longen is echter zeer moeilijk gebleken; de meerderheid van beeldvormende studies ex vivo of explantaat preparaten 20-23, die op het oog in de longen op enkele tijdstippen te benut. Terwijl deze voorbereidingen te doen geven nuttige informatie, ze niet over een volledig begrip van de interacties, oorzaak en gevolg relaties en dynamiek die plaatsvinden tussen de verschillende onderdelen van de micro-omgeving te geven. Het ontbreken van een goede bloedsomloop (en de daarmee gepaard gaande verstoring van de homeostase) en de ontkoppeling van de rest van het immuunsysteem van het lichaam maakt het wensen de conclusies die deze voorbereidingen te genereren in intacte weefsel in vivo te valideren.
Veel groepen hebben intravitale beeldvorming van de intacte long 2,4,5,24-33 met Wearn en Duits als eerste te chirurgisch bloot de pleura laag 24 en Terry als eerste een implanteerbare imaging venster 25 te gebruiken uitgevoerd.
Hoge resolutie beeldvorming in de longen sterk belemmerd door voortdurende beweging van de long en verschillende technieken ontwikkeld om deze beperking te overwinnen. Wagner en Filley 27 bestudeerde de natuurlijke beweging van de hond longen ontwierpen hun chirurgische protocol om hun geïmplanteerde venster vinden over een relatief stilstaande regio, terwijl Wagner gebruikt vacuüm in zijn raam chirurgische voorbereiding op het weefsel 28 te immobiliseren. Sinds die tijd hebben een verscheidenheid aan technieken zijn gebruikt om het beeld van de long waaronder: bronchus vastklemmen, sequentiële apneu en gated imaging, overbemonsterde overname, lijmen van de long kwab en vacuüm 34. Elk van deze heeft zijn voordelen en nadelen en niemand techniek is superieur gebleken een andere 34. Bijvoorbeeld, bronchus klem- en apneu sequentieel af aan het normale gasuitwisseling in de longen en kunnen atelectase veroorzaken. Gated beeldvorming en oversampled overname hebben geen last van deze nadelen, maar vereisen high-speed of gespecialiseerde grafische apparatuur niet breed toegankelijk. Slot worden lijmen van de long en de vacuümtechniek voorkomen beide bovengenoemde nadelen, maar kan afschuifkracht geïnduceerd letsel vertonen als zorg niet taknl. De laatste jaren heeft het vacuümvenster geminiaturiseerd en aangepast voor gebruik in muizen met behulp van confocale microscopie en multi-4,5,33 en uitstekende hoge-resolutie afbeelding is bereikt 2. Tabel 1 vat deze rijke geschiedenis en toont welke papieren die nieuwe beschrijven ontwikkelingen in het gebruik van intravitale longbeeldvorming ramen.
Dit protocol beschrijft het gebruik van verlengde time-lapse multiphoton intravitale microscopie om de afbeelding metastase in de live, intact long met de hoogst mogelijke resolutie subcellulaire. Beelden werden tot 12 uur met een multifoton microscoop met een hoge numerieke apertuur objectieflens en meerdere fotomultiplicatorbuis (PMT) detectoren. Transgene muismodellen worden gebruikt om fluorescent label inheemse macrofagen, samen met fluorescerende hoge gewicht dextran moleculaire en fluorescerend eiwit getransfecteerde tumorcellen (labelen het vaatstelsel en tumorcellen respectively). Hoewel de keuze van fluorescent gelabelde cellen maakt visualisatie van tumorcel-endotheelcel-macrofaag interacties en dynamiek dit protocol werken voor een stam van fluorescerende of niet-fluorescerende muis. Na de overname, wordt de resterende drift beweging (indien van toepassing) geëlimineerd met behulp van een Fiji plugin 35,36 en aangepaste macro's tijd het gemiddelde van de vasculaire kanaal te elimineren knipperen als gevolg van niet-gelabelde circulerende bloedcellen.
Hoewel dit protocol is gericht op beeldvorming metastase, de technieken zijn toepasbaar op vele andere biologische processen waarneembaar met hoge resolutie eencellige beeldvorming in de long.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoge resolutie in vivo optische beeldvorming in combinatie met fluorescent gelabelde functionele labels zoals eiwitten en antilichamen dramatisch toegenomen ons begrip van de metastatische cascade. Het heeft directe visualisatie en kwantificatie van single-cell en sub-cellulaire parameters in tumorcellen, gastheercellen en hun micro-omgeving ingeschakeld. Deze beeldvorming binnen de primaire tumor leidt bijvoorbeeld tot de ontdekking van discrete micromilieu dat ondersteunen ofwel groei invasie of verspreiding …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
- Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
- Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
- Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
- Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
- Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
- Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
- St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
- Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
- De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
- Wagner, W. W., Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
- Wagner, W. W. Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
- Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
- Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
- Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
- Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Hauser, H., Wagner, R. . Mammalian cell biotechnology in protein production. , (1997).
- Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
- Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).
