לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
גרורה לאתרים משניים כגון ריאות, כבד ועצמות הוא אירוע טראומטי עם שיעור תמותה של כ 90% 1. האתרים הללו, הריאה הוא קשה ביותר על מנת להעריך באמצעות דימות אופטי intravital בשל העמדה הסגורה שלו בתוך הגוף, הטבע עדין התפקיד חיוני בשמירת פיזיולוגיה נכונה. בעוד שיטות קליניות (טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה ממוחשבת (CT)) מסוגלות לספק תמונות לא פולשנית של רקמה זו, אין להם את הרזולוציה צורכת לדמיין את אירועי זריעה המוקדמים, עם פיקסל בודד המורכב מכמה אלפי תאים כמעט. דגמים נוכחיים של קביעת זריעת ריאות גרורתי שאירועים רק לאחר הגעתו של תאים סרטניים הם דטרמיניסטיים להישרדות והצמיחה הבאה. משמעות הדבר היא כי כלי הדמיה intravital בזמן אמת עם רזולוציה תא בודד 2 נדרשים על מנת להגדיר את פנוטיפים של cel זריעהls ולבדוק מודלים אלה. בעוד הדמיה אופטית גבוהה ברזולוציה של הריאה שבוצעה באמצעות הכנות vivo לשעבר שונות, ניסויים אלה הם בדרך כלל מבחני פעם אחת נקודות והם רגישים חפצי מסקנות אפשריות שגויות בשל הסביבה שינתה באופן דראמטי (טמפרטורה, שפע, ציטוקינים וכו ' וכתוצאה מכך) מהסרת מחלל החזה ומערכת הדם 3. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי הדמיה אופטית intravital זמן לשגות של הריאה השלמה אפשרי באמצעות ואקום התייצב 2,4,5 חלון הדמיה עם זאת, פעמי הדמיה טיפוסיות היו מוגבלות כ -6 שעות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לביצוע הדמיה זמן לשגות intravital לטווח ארוך של הריאה ניצול חלון כזה על פני תקופה של 12 שעות. רצפי הזמן לשגות התמונה שהושגו באמצעות שיטה זו לאפשר להדמיה לכמת תאי תאי אינטראקציות, דינמיקת הממברנה זלוף וסקולרית הבריאה. בנוסף, אנו דescribe טכניקת עיבוד תמונה שנותנת תצוגה ברורה וחסר תקדים על נימי הדם זעירות ריאות.
Introduction
הדמיה ברזולוציה גבוהה אופטית intravital הוכיחה להיות חיוני להבנת תהליכים ביולוגיים רבים, ומאפשרים פרמטרי תא בודד ואת המשנה הסלולר להימדד לכמת. בחקר הסרטן, הדמיה intravital של תאים סרטניים ואת סטרומה הובילה לגילוי של אינטראקציות microenvironmental רבים 6-11 שנמצאים רק החיה בשלמותה.
תגליות על microenvironments הקשורים intravasation והפצת תאים סרטניים בסרטן השד באמצעות דימות אופטי ברזולוציה תא בודד in vivo אף הביאה סמנים חדשניים הפרוגנוזה ועל התגובה לטיפול בחולי סרטן השד 12-16. טכנולוגיות ההדמיה הטובות ביותר הזמינות לצפייה עמוקה בתוך האיברים חיוניים הפנימיים שלמים הן השיטות הקליניות (MRI, PET, CT) אשר מציעות נופים מצוינים של האיבר כולו והוא יכול לחשוף פתולוגיות עוד לפני שהם מייצרים סימפטומים קליניים. הם אינם מסוגלים, however, כדי לחשוף את השלבים המוקדמים של גרורות ואת המנגנונים התאיים נהיגת התקדמות גידול בשל חוסר ברזולוצית תא בודד. עד גרורות סרטני בריאות גלויות באופנים אלה, הם מבוססים היטב התרבה. נוכח ההערכה כי 90% של תאים סרטניים שהפיץ מגיעים אל הריאות או אינם שורדים 17 או בתחילה להישאר רדומים 18, ואת התצפית כי הם מגיעים הרבה יותר מוקדם מהצפוי בעבר 19, הדמיה השלבים המוקדמים ההגעה והישרדות הופך קריטי הבנת התהליך של זריעה והישנות גרורתי של גידול באתרים מרוחקים.
ביצוע תצפיות אלה הריאה הוכיח קשה מאוד עם זאת; הרוב המכריע של מחקרי הדמיה נצל הכנות vivo לשעבר או explant 20-23, אשר רק לתת תצוגה לתוך הריאות בנקודות פעם אחת. בעוד הכנות אלה מספקות מידע שימושיrmation, הם לא נותנים הבנה מלאה של אינטראקציות, יחסי סיבה ותוצאה, ודינמיקה המתרחשות בין הרכיבים השונים של microenvironment. עדר מערכת דם תקין (וחוסר איזון קשור של הומאוסטזיס) ואת הניתוק משאר המערכת החיסונית של הגוף עושה את זה שוקק כדי לאמת את המסקנות כי ההכנות האלה ליצור ברקמת שלמי in vivo.
קבוצות רבות בצעו הדמית intravital של הריאה השלמה 2,4,5,24-33 עם Wearn וגרמנית להיות הראשון כמנתח לחשוף את שכבת פלאורלי 24 וטרי הראשון שניצלו את חלון הדמיה מושתל 25.
הדמיה ברזולוציה גבוהה הריאה מתעכבת מאוד על ידי התנועה המתמדת וטכניקות מספר של הריאות פותחו כדי להתגבר על מגבלה זו. ואגנר Filley 27 למד את התנועה הטבעית של הריאה כלביםועוצב הפרוטוקול כירורגית שלהם לאתר החלון המושתל שלהם מעל אזור יחסית נייח בעוד וגנר מנוצל ואקום כהכנה כירורגית חלונו כדי לשתק את הרקמות 28. מאז אותה תקופה, מגוון של טכניקות כבר נוצל לתדמית הריאה כולל: הידוק הסמפונות, דום נשימה רציפה הדמיה מגודרת, רכישת oversampled, הדבקה של אונת ריאת ואקום 34. לכל אלה היתרונות והחסרונות שלה ולא טכניקה אחת התפתחה כנעלה על 34 אחר. לדוגמא, clamping הסמפונות דום נשימה רציפה לשנות את חילופי דברים הרגילים של גזי הריאה ועלולים לגרום תמט ריאות. הדמיה מגודרת ורכישת oversampled אינן סובלות חסרון אלה אך דורשים במהירות גבוהה או ציוד הדמיה מיוחד לא נגיש לציבור רחב. לבסוף הוא דבק של הריאה ואת הטכניקה ואקום להימנע הם החסרונות שהוזכרו לעיל, אך עשויים להפגין פגיעה הנגרם כוח גזירה אם טיפול אינו taken. בשנים האחרונות, חלון הוואקום כבר מיניאטורי ומותאם לשימוש בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה confocal multiphoton 4,5,33 ו הדמיה ברזולוציה גבוהה מעולה שהושג 2. טבלת 1 מסכמת היסטוריה עשירה זה ומדגיש את הניירות האלה המתארים רומן התקדמות בשימוש חלונות הדמיה ריאות intravital.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ intravital multiphoton המורחב זמן לשגות כדי גרורות תמונת הריאה החייה, השלמה עם החלטת subcellular הגבוהה ביותר האפשרית. תמונות נרכשות עבור עד 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מצויד בעדשת מטרת צמצם המספרי גבוהה צינור מכפיל מרובה (PMT) גלאי. מודלים עכבר מהונדס מנוצלים מקרופאגים יליד תווית fluorescently יחד עם dextran משקל מולקולרי גבוה פלורסנט תאים סרטניים טרנספקציה פלורסנט חלבון (לתייג התאים בכלי הדם ואת הגידול respectively). בעוד שבחירה זו של תאים שכותרתו fluorescently מאפשרת הדמיה של אינטראקציות מקרופאג תא האנדותל תאים סרטניים ודינמיקה, פרוטוקול זה יעבוד עבור כל זן של העכבר פלורסנט או ללא ניאון. לאחר רכישה, תנועה להיסחף שיורית (אם בכלל) מסולקת באמצעות פיג'י תוסף 35,36 וממוצע זמן פקוד מאקרו מותאמת אישית בערוץ וסקולרית לחסל הבהוב הנגרם על ידי תאי דם במחזור ללא תווית.
בעוד פרוטוקול זה מתמקד גרורות הדמיה, הטכניקות החלות על תהליכים ביולוגיים רבים אחרים הנצפה עם הדמית תא בודד ברזולוציה גבוהה הריאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
רזולוציה גבוהה הדמיה אופטית vivo בשילוב עם תגים תפקודיים שכותרתו fluorescently כגון חלבונים ונוגדנים יש עלה באופן משמעותי את הבנתנו של המפל גרורתי. זה איפשר להדמיה ישירה וכימות של תא בודד ופרמטרים המשנה הסלולר בתאי גידול, תאי המארח microenvironment שלהם. הדמיה זו בתוך הגיד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
- Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
- Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
- Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
- Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
- Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
- Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
- St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
- Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
- De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
- Wagner, W. W., Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
- Wagner, W. W. Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
- Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
- Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
- Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
- Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Hauser, H., Wagner, R. . Mammalian cell biotechnology in protein production. , (1997).
- Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
- Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).
