एक वैक्यूम स्थिर इमेजिंग खिड़की के साथ फेफड़ों में लंबे समय तक उच्च संकल्प intravital माइक्रोस्कोपी
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
इस तरह के फेफड़े, जिगर और हड्डी के रूप में माध्यमिक साइट्स के लिए मेटास्टेसिस लगभग 90% 1 की मृत्यु दर के साथ एक दर्दनाक घटना है। इन साइटों में से, फेफड़ों शरीर, नाजुक प्रकृति और उचित शरीर क्रिया विज्ञान को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका के भीतर अपनी संलग्न स्थिति की वजह से सबसे कठिन intravital ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग का आकलन करने के लिए है। जबकि नैदानिक तौर तरीकों (पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और गणना टोमोग्राफी (सीटी)) इस ऊतक के noninvasive छवियों को प्रदान करने में सक्षम हैं, वे जल्द से जल्द संकल्प बोने की घटनाओं कल्पना करने के लिए आवश्यक है, एक एकल पिक्सेल के साथ की कमी लगभग एक हजार कोशिकाओं से मिलकर। मेटास्टेटिक फेफड़ों बोने मांगना के मौजूदा मॉडल है कि घटनाओं को सिर्फ एक ट्यूमर सेल के आने के बाद अस्तित्व और बाद के विकास के लिए निर्धारक हैं। इसका मतलब यह है कि एकल कोशिका संकल्प 2 के साथ वास्तविक समय intravital इमेजिंग उपकरण के क्रम में बोने सेल के phenotypes को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैंलोकसभा और इन मॉडलों का परीक्षण करें। जबकि उच्च संकल्प फेफड़ों के ऑप्टिकल इमेजिंग विभिन्न पूर्व vivo तैयारियों का उपयोग किया गया है, इन प्रयोगों को आम तौर पर एक समय बिंदु assays हैं और नाटकीय रूप से बदल माहौल की वजह से कलाकृतियों और संभव गलत निष्कर्ष करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं (तापमान, प्रचुरता, साइटोकिन्स, आदि ) छाती गुहा और संचार प्रणाली 3 से हटाने से उत्पन्न। हाल ही में काम दिखाया गया है बरकरार फेफड़ों की उस समय व्यतीत हो जाने के intravital इमेजिंग ऑप्टिकल संभव है का उपयोग कर एक निर्वात स्थिर इमेजिंग खिड़की 2,4,5 हालांकि, ठेठ इमेजिंग बार लगभग 6 घंटा तक ही सीमित कर दिया गया है। यहाँ हम फेफड़ों के 12 घंटा की अवधि में इस तरह के एक खिड़की के उपयोग के लिए लंबी अवधि के intravital इमेजिंग समय चूक के प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। समय चूक छवि इस विधि का उपयोग कर प्राप्त दृश्यों फेफड़ों में दृश्य और सेल सेल बातचीत के quantitation, झिल्ली गतिशीलता और संवहनी छिड़काव सक्षम करें। हम आगे घएक छवि प्रसंस्करण तकनीक फेफड़ों microvasculature की एक अभूतपूर्व स्पष्ट विचार देता है कि खींचाना।
Introduction
उच्च संकल्प intravital इमेजिंग ऑप्टिकल कई जैविक प्रक्रियाओं, की अनुमति एकल कोशिका और उप सेलुलर मानकों को मापा और मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए समझने के लिए महत्वपूर्ण साबित हो गया है। कैंसर अनुसंधान में, ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के intravital इमेजिंग कई microenvironmental बातचीत 6-11 कि अक्षुण्ण जानवर में ही मौजूद हैं की खोज करने के लिए प्रेरित किया है।
विवो में एकल कक्ष संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग स्तन कैंसर में intravasation और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार के साथ जुड़े microenvironments खोजों के बारे में भी रोग का निदान और स्तन कैंसर के रोगियों 12-16 में उपचार के जवाब के लिए उपन्यास मार्करों के लिए प्रेरित किया है। सबसे अच्छा इमेजिंग तकनीक बरकरार आंतरिक महत्वपूर्ण अंगों के भीतर गहरे देखने के लिए उपलब्ध नैदानिक तौर तरीकों (एमआरआई, पीईटी, सीटी) जो पूरे अंग के उत्कृष्ट विचारों की पेशकश और विकृतियों का पता चलता है पहले भी वे नैदानिक लक्षण पैदा कर सकते हैं। वे असमर्थ हैं, जowever, एकल कोशिका संकल्प की कमी के कारण मेटास्टेसिस के शुरुआती दौर और सेलुलर तंत्र ट्यूमर प्रगति ड्राइविंग प्रकट करते हैं। समय से फेफड़ों के मेटास्टेसिस इन तौर-तरीकों में दिखाई दे रहे हैं, वे अच्छी तरह से स्थापित और proliferating हैं। अनुमान यह देखते हुए कि फैलाया ट्यूमर कोशिकाओं है कि फेफड़ों के लिए आ सकते हैं या तो 17 जीवित नहीं है या शुरू में निष्क्रिय रहने के 18, और अवलोकन है कि वे बहुत पहले से पहले अपेक्षा 19, इमेजिंग आगमन और अस्तित्व का जल्द से जल्द कदम पहुंचने का 90% करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है दूर साइटों पर मेटास्टेटिक बोने और ट्यूमर के विकास की पुनरावृत्ति करने की प्रक्रिया को समझने।
फेफड़ों में इन टिप्पणियों प्रदर्शन हालांकि बेहद मुश्किल साबित हो गया है; इमेजिंग अध्ययन के विशाल बहुमत के पूर्व vivo या explant तैयारियों 20-23, जो केवल एक समय बिंदुओं पर फेफड़ों में एक दृश्य देने का उपयोग किया है। इन तैयारियों उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैंrmation, वे बातचीत, कारण और प्रभाव के रिश्ते, और गतिशीलता है कि microenvironment के विभिन्न घटकों के बीच होने की पूरी समझ नहीं देते। एक उचित संचार प्रणाली (और homeostasis के सहवर्ती असंतुलन) और शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली के बाकी हिस्सों से वियोग की कमी के कारण यह इच्छुक निष्कर्ष है कि इन तैयारियों विवो में बरकरार ऊतकों में उत्पन्न मान्य करने के लिए बनाता है।
कई समूहों Wearn और जर्मन पहली फुफ्फुस परत 24 को बेनकाब करने के लिए शल्य चिकित्सा और टेरी पहले एक implantable इमेजिंग खिड़की 25 उपयोग करने के लिए किया जा रहा है के साथ बरकरार फेफड़ों 2,4,5,24-33 के intravital इमेजिंग प्रदर्शन किया है।
फेफड़ों में उच्च संकल्प इमेजिंग बहुत फेफड़ों के निरंतर गति से रुकावट है और कई तकनीकों इस सीमा को पार करने के लिए विकसित किया गया है। वैगनर और Filley 27 कुत्ते फेफड़ों की स्वाभाविक गति का अध्ययनऔर एक अपेक्षाकृत स्थिर क्षेत्र पर उनकी प्रत्यारोपित खिड़की का पता लगाने के लिए है जबकि वैगनर उसकी खिड़की शल्य चिकित्सा की तैयारी में वैक्यूम उपयोग किया ऊतक 28 स्थिर करने के लिए उनकी शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल बनाया गया है। श्वसनी clamping, अनुक्रमिक एपनिया और gated इमेजिंग, oversampled अधिग्रहण, फेफड़ों पालि और वैक्यूम 34 के gluing: उस समय के बाद से, तकनीक की एक किस्म की छवि के लिए सहित फेफड़ों उपयोग किया गया है। इनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान है और कोई भी तकनीक एक और 34 के रूप में बेहतर उभरा है। उदाहरण के लिए, श्वसनी clamping और अनुक्रमिक एपनिया फेफड़ों में गैसों के सामान्य विनिमय में परिवर्तन और श्वासरोध का कारण बन सकता है। Gated इमेजिंग और oversampled अधिग्रहण इन नुकसान से ग्रस्त नहीं है, लेकिन उच्च गति या विशेष इमेजिंग उपकरणों व्यापक रूप से सुलभ नहीं की आवश्यकता होती है। अंत में फेफड़ों के दोनों gluing और वैक्यूम तकनीक से ऊपर उल्लेख किया कमियों के दोनों बचने के लिए, लेकिन कतरनी बल प्रेरित चोट प्रदर्शन कर सकते हैं अगर ध्यान Tak नहीं हैएन। हाल के वर्षों में, निर्वात खिड़की छोटी किया गया है और confocal और multiphoton माइक्रोस्कोपी 4,5,33 और उत्कृष्ट उच्च संकल्प इमेजिंग का उपयोग चूहों में उपयोग के लिए अनुकूलित प्राप्त किया गया है 2। तालिका 1 इस समृद्ध इतिहास का सार है और उन कागजात जो उपन्यास का वर्णन पर प्रकाश डाला गया intravital इमेजिंग फेफड़ों खिड़कियों के उपयोग के क्षेत्र में प्रगति।
इस प्रोटोकॉल उच्चतम subcellular संकल्प के साथ जीना संभव बरकरार फेफड़ों में छवि मेटास्टेसिस के लिए विस्तृत समय व्यतीत हो जाने के multiphoton intravital माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन। छवियाँ एक multiphoton एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस और कई photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) डिटेक्टरों से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए 12 घंटे के लिए हासिल किया है। ट्रांसजेनिक माउस मॉडल फ्लोरोसेंट उच्च आणविक भार dextran और फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रांसफ़ेक्ट ट्यूमर कोशिकाओं (लेबल करने के लिए वाहिका और ट्यूमर कोशिकाओं respectivel के साथ fluorescently लेबल मूल निवासी मैक्रोफेज करने के लिए उपयोग किया जाता हैy)। fluorescently लेबल कोशिकाओं के इस चुनाव ट्यूमर सेल endothelial सेल-बृहतभक्षककोशिका बातचीत और गतिशीलता के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है, वहीं इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट या गैर फ्लोरोसेंट माउस के किसी भी तनाव के लिए काम करेंगे। अधिग्रहण के बाद, अवशिष्ट बहाव मोशन (अगर कोई है) लेबल हटाया गया घूम रक्त कोशिकाओं की वजह से चमकती समाप्त करने के लिए एक प्लगइन फिजी 35,36 और कस्टम मैक्रोज़ समय औसत संवहनी चैनल का उपयोग समाप्त हो रहा है।
इस प्रोटोकॉल इमेजिंग मेटास्टेसिस पर केंद्रित है, तकनीक कई अन्य जैविक फेफड़ों में उच्च संकल्प एकल कोशिका इमेजिंग के साथ नमूदार प्रक्रियाओं को लागू कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
विवो ऑप्टिकल ऐसे प्रोटीन और एंटीबॉडी के रूप में fluorescently लेबल कार्यात्मक टैग के साथ संयुक्त इमेजिंग में उच्च संकल्प नाटकीय रूप से मेटास्टेटिक झरना के बारे में हमारी समझ को बढ़ा दिया है। यह प्रत्यक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
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