Definiera substratspecificiteter för lipas och fosfolipas kandidater
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
Mikroorganismer producerar ett brett spektrum av (fosfo) lipaser som utsöndras, för att göra externa substrat tillgängligt för organismen. Alternativt kan andra (fosfo) lipaser fysiskt i samband med den producerande organism som orsakar en omsättning på inneboende lipider och ofta ger upphov till en ombyggnad av cellmembran. Även potentiella (fosfo) lipaser kan förutsägas med ett antal algoritmer när genen / proteinsekvensen är tillgänglig, experimentellt bevis på enzymaktiviteter, substrat särdrag och potentiella fysiologiska funktioner har ofta inte uppnåtts. Detta manuskript beskriver optimering av analysbetingelser för blivande (fosfo) lipaser med okända substrat särdrag och hur man kan använda dessa optimerade betingelser i sökandet efter det naturliga substratet av en respektive (fosfo) lipas. Med hjälp av artificiell kromogena substrat, såsom p-nitrofenyl-derivat, kan bidra till att upptäcka en mindreenzymatisk aktivitet för en förutsagd (fosfo) lipas under standardbetingelser. Efter att ha stött på en sådan mindre enzymatisk aktivitet, kan de distinkta parametrar för en enzymanalys varieras i syfte att erhålla en mer effektiv hydrolys av det artificiella substratet. Efter att ha fastställt de villkor som ett enzym fungerar väl, bör en mängd potentiella naturliga substrat analyseras för deras nedbrytning, en process som kan följas med användning av olika kromatografiska metoder. Definitionen av substratspecificiteter för nya enzymer, ger ofta hypoteser för en potentiell fysiologiska rollen för dessa enzymer, som sedan kan testas experimentellt. Efter dessa riktlinjer, kunde vi identifiera en fosfolipas C (SMc00171) som försämrar fosfatidylkolin att fosfokolin och diacylglycerol, i ett avgörande steg för ombyggnaden av membran i bakterien Sinorhizobium meliloti på fosfor begränsande förutsättningarna för tillväxt. För två förutsagda patatin-som fosfolipaser (SMc00930 och SMc01003) av samma organism, kan vi omdefiniera sina substratspecificiteter och klargöra att SMc01003 är en diacylglycerol lipas.
Introduction
Glycerol baserade lipider såsom triacylglyceroler och (glycero) fosfolipider utgör viktiga och förmodligen den mest kända lipid klasser 1. Triacylglyceroler (taggar) är fetter eller oljor, som vanligtvis fungerar som förvarings lipider, och därmed som potentiell energi och kolkällor. TAG kan brytas ned av lipaser, som ofta utsöndras av den producerande organismen att smälta externa taggar och göra dem tillgängliga som kolkällor. Dessutom har lipaser studerats ingående under årens lopp på grund av deras viktiga biotekniska tillämpningar 2.
På grund av sin amfifila karaktär och deras nära cylindrisk form, (glycero) fosfolipider uppvisar membranbildande egenskaper och oftast utgör de viktigaste lipida komponenterna i en tvåskiktad membran 3. I enkla mikroorganismer, såsom bakterien Escherichia coli, endast tre stora huvudgrupp-varianter, fosfatidylglycerol (PG), kardiolipin (CL), och fosfatidylethanolamine (PE) påträffas, men man bör vara medveten om att var och en av dem kan ersättas med ett stort antal olika fettacylkedjor vid sn-1- eller sn-2 positionen som ger upphov till ett stort antal olika molekylslag 4 . Andra bakterier kan ha andra fosfolipider förutom eller i stället. Exempelvis Sinorhizobium meliloti, en jordbakterie, som är i stånd att bilda en kvävefixerande root knuta symbios med baljväxter alfalfa (Medicago sativa), innehåller förutom till PE en andra zwitterjonisk fosfolipid, fosfatidylkolin (PC) 5. Också, lipider som inte innehåller fosfor eller glycerol kan vara amfifil och utgör en del av det cellulära membranet. Till exempel, vid fosfor-begränsande tillväxtbetingelser, i S. meliloti, (glycero) fosfolipider är till stor del ersatts av membranlipider som inte innehåller fosfor, dvs, sulfolipider, ornitin lipider, och diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. I bakterier, är DGTS bildas från diacylglycerol (DAG) i en tvåstegs vägen 7 men källan för DAG generationen var inte klart. Puls-chase experiment antydde att PC kan vara en föregångare för DGTS 8 och använda den metod som beskrivs i detta manuskript vi kunde identifiera en fosfolipas C (PLCP, SMc00171) som bildas under fosforbegränsande förhållanden och som kan omvandla PC till DAG och fosfokolin 8.
I en separat studie, upptäckte vi att en acyl-CoA-syntetas (FADD) med brist på mutant av S. meliloti eller av Escherichia coli ackumulerade fria fettsyror vid inträde stationära tillväxtfasen 9. Även om dessa fettsyror tycktes vara härledda från membranlipider, var den exakta källan för de fria fettsyrorna eller enzymet (enzymerna) befriande dem inte känd. Återigen, som använder den strategi som beskrivs i detta manuskript, två patatin liknande 10 (fosfo) lipaser (SMc00930 och SMc01003) som bidrog till bildandet av fria fettsyror i S. meliloti 11 förutsågs. Överraskande, används SMc01003 DAG som substrat omvandla den till monoacylglycerol och slutligen glycerol och fria fettsyror 11. Därför är SMc01003 en DAG lipas (DGLA).
Även om ett antal algoritmer finns för att förutsäga potentiell (fosfo) lipaser 12,13, deras exakta funktion och fysiologiska roll är oftast inte känt. Här redogör vi ett protokoll för att klona och överuttrycker förutsagda eller potentiella (fosfo) lipaser. Detta manuskript förklarar hur enzymanalyser kan utvecklas och optimeras för överuttryckt (fosfo) lipas med hjälp av artificiella kromogena substrat. Vi ger exempel på hur med en optimerad enzymanalys den verkliga (fosfo) lipassubstrat kan inträffa och hur dessa resultat kan berika vår förståelse av mikrobiell fysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under de senaste 20 åren, har genomen hos många organismer sekvenserats och även en mängd genomsekvensdata har genererats, är funktionell tolkning släpar efter och hindrar därför vår förståelse av genomet funktion. Genfunktioner i genomen ofta tilldelas baserat på likhet med gener med känd funktion eller förekomst av bevarade motiv. Emellertid är den exakta funktionen av en given gen ofta inte känd. Speciellt förutspådde strukturella gener för enzymer kan inte vara lätt att utforskas med miska teknik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-Mexiko (CONACYT-Mexiko) (82.614, 153.998, 253.549 och 178.359 i Investigación Científica Básica samt 118 i Investigación en Front de la Ciencia) och från Dirección General de Asuntos de personliga Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM, PAPIIT IN202616, IN203612).
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
Riferimenti
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
- Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
- De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
- Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
- Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
- Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
- Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
- Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
- Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
- Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
- Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
- Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
- Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
- Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
- Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
- Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
- Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
- Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
