تحديد الركيزة الخصوصيات لالليباز وفسفوليباز المرشحين
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
الكائنات الحية الدقيقة وتنتج مجموعة واسعة من (الفوسفات) الليباز التي تفرز من أجل جعل ركائز الخارجية المتاحة للكائن الحي. بدلا من ذلك، وغيرها (الفوسفات) يباسيس قد تترافق مع جسديا الكائن إنتاج يسبب دوران من الدهون الذاتية وأفسحت المجال لإعادة تشكيل الأغشية الخلوية في كثير من الأحيان. على الرغم من أن المحتملة (الفوسفات) يباسيس يمكن التنبؤ بها مع عدد من الخوارزميات عندما تسلسل الجين / بروتين متاح، وكثيرا ما لم يتم الحصول على دليل تجريبي من الأنشطة الإنزيمية والخصوصيات الركيزة، والوظائف الفسيولوجية المحتملة. توضح هذه المخطوطة وتعظيم الاستفادة من الظروف فحص لالمحتملين (الفوسفات) يباسيس مع خصوصيات الركيزة غير معروفة وكيفية توظيف هذه الظروف الأمثل في البحث عن الركيزة الطبيعية من (الفوسفات) الليباز منها. استخدام ركائز اللونية الاصطناعية، مثل المشتقات ص -nitrophenyl، قد تساعد على كشف قاصرالنشاط الأنزيمي لتوقع (الفوسفات) الليباز في ظل ظروف قياسية. وبعد أن واجه مثل هذه النشاط الأنزيمي البسيط و المعلمات متميزة لفحص انزيم يمكن أن تختلف من أجل الحصول على التحلل أكثر كفاءة من الركيزة الاصطناعية. بعد أن تحدد الظروف التي انزيم يعمل بشكل جيد، يجب أن يعاير مجموعة متنوعة من ركائز الطبيعية المحتملة لتدهورها، وهي العملية التي يمكن اتباعها توظيف أساليب الكروماتوغرافي متميزة. تعريف خصوصيات الركيزة للإنزيمات جديدة، غالبا ما يقدم فرضيات لدور الفسيولوجية المحتمل لهذه الإنزيمات، التي ثم يمكن اختبارها تجريبيا. وعقب هذه المبادئ التوجيهية، كنا قادرين على تحديد فسفوليباز C (SMc00171) التي تحط فسفاتيديل إلى phosphocholine ومادة ال diacylglycerol، في خطوة حاسمة لإعادة تشكيل الأغشية الموجودة في بكتيريا Sinorhizobium meliloti على شروط تحد من الفوسفور للنمو. لمدة توقع patatin-مثل فوسفوليباز (SMc00930 وSMc01003) من نفس الحي، ونحن يمكن إعادة تعريف خصوصيات الركيزة وتوضيح أن SMc01003 هو الليباز مادة ال diacylglycerol.
Introduction
الدهون القائم على الجلسرين مثل triacylglycerols و(glycero) الفوسفورية تشكل مهمة وربما الطبقات الشحمية الأكثر شهرة 1. Triacylglycerols (العلامات) هي الدهون أو الزيوت، والتي تعمل عادة على نسبة الدهون في التخزين، وبالتالي كمصادر الطاقة والكربون المحتملة. الكلمات يمكن أن يتحلل من الليباز، والتي كثيرا ما يفرز من قبل الكائن الحي إنتاج الهضم الكلمات الخارجية وجعلها متاحة كمصدر للكربون. أيضا، يباسيس وقد درس على نطاق واسع خلال السنوات نظرا لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية الهامة. 2.
نظرا لطبيعة محبة للجهتين وشكلها شبه اسطواني، (glycero) الفوسفورية خواص تشكيل غشاء وتشكل عادة مكونات شحمي الرئيسية للغشاء bilayered 3. في الكائنات الحية الدقيقة بسيطة، مثل البكتيريا القولونية، فقط ثلاثة متغيرات رئيس مجموعة كبيرة، phosphatidylglycerol (PG)، كارديوليين (CL)، وphosphatidواجهت ylethanolamine (PE)، على الرغم من واحد يجب أن يكون على علم بأن كل واحد منهم يمكن أن تكون بديلا مع عدد كبير من مختلف سلاسل أسيل الدهنية في التعطيل -1 أو -2 موقف SN مما أدى إلى عدد كبير من مختلف الأنواع الجزيئية 4 . قد يكون بكتيريا أخرى الفوسفورية أخرى بالإضافة أو بدلا من ذلك. على سبيل المثال، Sinorhizobium meliloti، بكتيريا التربة، والتي هي قادرة على تشكيل جذور العقيدات التعايش المثبتة للنيتروجين مع البرسيم البقوليات (الحجازي)، ويتضمن بالإضافة إلى المؤسسة العامة ثان فوسفورية zwitterionic، فسفاتيديل (PC) 5. أيضا، والدهون لا تحتوي على الفوسفور أو الجلسرين قد تكون محبة للجهتين وتشكل جزءا من الغشاء الخلوي. على سبيل المثال، على ظروف النمو، يحد من الفوسفور، في س. meliloti، يتم استبدال (glycero) الفوسفاتية إلى حد كبير من نسبة الدهون في غشاء التي لا تحتوي على الفوسفور، أي sulfolipids، والدهون الأورنيثين، وdiacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. في البكتيريا، ويتم تشكيل DGTS من مادة ال diacylglycerol (داج) في مسار من خطوتين 7 ولكن كان مصدر لتوليد داج غير واضح. وتشير التجارب نبض مطاردة الكمبيوتر قد تكون مقدمة لDGTS 8 و باستخدام المنهجية الموصوفة في هذه المخطوطة استطعنا تحديد فسفوليباز C (PlcP، SMc00171) التي يتم تشكيلها بموجب شروط تحد من الفوسفور والتي يمكن تحويل الكمبيوتر إلى داج وphosphocholine 8.
وفي دراسة منفصلة، اكتشفنا أن مخلقة أسيل، لجنة الزراعة (FadD) متحولة -deficient س meliloti أو من الإشريكية القولونية تراكم الأحماض الدهنية الحرة عند دخول مرحلة ثابتة من 9 النمو. على الرغم من أن هذه الأحماض الدهنية يبدو أن تستمد من الدهون غشاء، المصدر الدقيق للأحماض الدهنية الحرة أو الانزيم (ق) تحريرهم لم تكن معروفة. مرة أخرى، وتوظيف الاستراتيجية الواردة في هذه المخطوطة، وهما 10 (الفوسفات) يباسيس مثل patatin (SMc00930 وSMc01003) التي ساهمت في تكوين الأحماض الدهنية الحرة في س. وتوقع meliloti 11. والمثير للدهشة، وتستخدم SMc01003 همرشولد الركيزة تحويله إلى monoacylglycerol وأخيرا الجلسرين والأحماض الدهنية الحرة 11. لذلك، SMc01003 هو الليباز داغ (DglA).
ورغم أن عددا من الخوارزميات وجود للتنبؤ المحتملين (الفوسفات) يباسيس 12،13، وظيفتها دقيقة وغير معروفة عادة دور الفسيولوجية. نحن هنا الخطوط العريضة لبروتوكول، لاستنساخ وبإفراط توقع أو المحتملة (الفوسفات) الليباز. توضح هذه المخطوطة كيف المقايسات الإنزيم يمكن تطوير وتحسين ل(الفوسفات) الليباز overexpressed باستخدام ركائز اللونية الاصطناعية. نحن نقدم أمثلة كيف مع فحص انزيم الأمثل الحقيقية (الفوسفات) الليباز الركيزة يمكن أن يكون مصادفة، وكيف يمكن أن تثري هذه النتائج فهمنا للعلم وظائف الأعضاء الميكروبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على مدى السنوات ال 20 الماضية، تم التسلسل جينومات العديد من الكائنات الحية وعلى الرغم من ثروة من البيانات تسلسل الجينوم قد ولدت، وتفسير وظيفي لا يزال متخلفا، وبالتالي يعيق فهمنا من وظيفة الجينوم. وغالبا ما تسند وظائف الجينات في الجينوم على أساس التشابه في الجينات وظي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المجلس الوطني للعلوم بحوث والتكنولوجيا والمكسيك (CONACYT والمكسيك) (82614، 153998، 253549، و178359 في INVESTIGACION CIENTIFICA باسيكا وكذلك 118 في INVESTIGACION أون Fronteras دي لا Ciencia) ومن المديرية العامة لل Asuntos دي الشخصية Académico-الجامعة الوطنية المستقلة بالمكسيك (DGAPA-UNAM، PAPIIT IN202616، IN203612).
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
Riferimenti
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
- Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
- De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
- Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
- Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
- Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
- Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
- Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
- Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
- Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
- Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
- Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
- Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
- Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
- Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
- Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
- Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
- Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
