Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK
Summary
שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.
Abstract
Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.
Introduction
במסגרת ההרג הטבעי מערכת חיסון המולדת (NK) תאים לתרום קו ההגנה הראשון נגד שנדבק בנגיף או רע ומר טרנספורמציה תאים. מערכת של קולטנים מעכב והפעלה מאפשרת להם להבחין בין תאים בריאים טרנספורמציה ללא תחול אנטיגן לפני בניגוד לתאי T. לאחר מפגש תא המטרה תא NK לשחרר את התוכן של הגרגרים שלהם ציטוטוקסיות (למשל, perforin, granzymes) לתוך הסינפסה החיסונית להרוג היעד שלהם. יתר על כן, תאי NK מייצרים ומפרישים סוגים שונים של ציטוקינים (למשל, γ interferon-: IFN-γ; הגידול נמק-α גורם: TNF-α) וכמוקינים (למשל,-1β חלבון דלקתי מקרופאג: MIP-1β) על תא המטרה אינטראקציה או ציטוקינים גירוי 1.
מספיק פונקציות תא NK כגון רעילות, chemokine וייצור ציטוקינים יש השפעה חשובה על גורל דיס מגווןמקל. חולי לוקמיה להראות גדל בשיעור ההתקפים אם הם מפגינים פרופיל תא NK פגום בעת האבחנה המורכב של ייצור IFN-γ מופחת התבטאות מופחתת של הפעלת 2 לקולטנים המצויים בתאי NK. התאוששות מוקדמת של מספרים הסלולריים NK ותפקוד כולל ייצור ציטוקינים על אינטראקצית תא המטרה קשורה להרע מופחת שיעור הישרדות משופר בחולים מקבל השתלת תאי גזע אלוגנאית 3. יתר על כן, על התחלת טיפול אינטרפרון בחולים שנדבקו בנגיף הפטיטיס C קיבולת degranulation של תאים היקפיים NK הוא חזק המגיבים מוקדם מאשר שלא הגיבו לטיפול 4. מספרי תא NK (> 80 / μl) ביום 15 לאחר השתלת מח עצם אוטולוגית (autoSCT) בחולים הסובלים מלימפומה או מיאלומה נפוצה הם המנבאים התקדמות משופרת חופשית הכוללת הישרדות 5. בחולים מלנומה הביטוי של T-cell immunoglobulin- ו mucin-מושלם-containinמולקולת -3 G (TIM-3), חלבון חיסוני רגולציה על תאי NK, עולה בקנה אחד עם שלב מחלה והפרוגנוזה 6.
מדעני פיקוח פונקציות תא NK לאורך העשורים האחרונים. הניתוח הראשוני של cytotoxicity תא NK כנגד תאים סרטניים ללא תחול לפני טופל באמצעות assay 51 Cr-שחרור 7. לאחרונה, מדענים פתחו שיטה שאינה רדיואקטיבי כדי להעריך את הרעילות של תאי NK המורחבים 8. ייצור ציטוקינים ו chemokine נבדק לעתים קרובות באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) טכניקות 9,10. במהלך העשורים האחרונים שיטות אלה כבר כהשלמת מבחני זרימה מבוססת cytometry. השימוש מעכבי תחבורת חלבון (לדוגמא, brefeldin ו monensin) ושיטות התא permeabilization בשילוב עם פרוטוקולים מכתימים קונבנציונלי שטח אפשר למדענים לחקור chemokine וייצור ציטוקינים ב הלימפה ספציפית שונהתת ocyte (למשל, T, B או תאי NK) 11. יתר על כן, מבחני cytometry מבוסס זרימה שונה פותחו כדי לפקח T ו- NK cytotoxicity תא. בשנת 2004 אלתר ואח. תאר את ביטוי השטח של החלבון ליזוזום הקשורים CD107a (Lamp1) על תאי NK על מפגש תא המטרה כסמן עבור degranulation של גרגרי ציטוטוקסיות 12. מאז מגוון רחב של fluorochromes השונה cytometers זרימת רב ערוצית זמין בימינו, זה הפך להיות אפשרי לפקח בו זמנית פונקציות תא NK מגוונות (cytotoxicity, ציטוקינים וייצור chemokine) תת תאים שונים NK. זה הופך להיות חשוב במיוחד במצבים בהם גודל המדגם מוגבל, למשל, ב ביופסיות או דגימות דם של חולים הסובלים לויקופניה.
כדי לבדוק פונקציות תא NK העולמיות, מבחני הזרימה השונה מבוסס cytometry ניתן לשלב ביעילות. Theorell et al. תאי NK מגורה מ heaתורמי lthy עם קו התאים הסרטניים K562 ונותח degranulation תא NK, ייצור אות ו chemokine מבפנים החוצה באמצעות זרימת cytometry 13. לאחרונה תת-קבוצות תא NK, פנוטיפים ופונקציות בחולי גידול בזמן autoSCT נותחו באמצעות לזרום מבחני cytometry מבוססים. זה הודגם כי תאי NK הצליחו degranulate ולייצר ציטוקינים / כמוקינים בעת ההכרה תאים סרטניים בנקודות מוקדם מאוד זמן אחרי autoSCT 11.
הנה פרוטוקול מתואר להעריך פונקציות תא NK על אינטראקציה עם תאים סרטניים כוללים קיבולת degranulation, chemokine וייצור ציטוקינים באמצעות זרימה cytometry המבוסס assay זה עושה את זה ניתן לבצע מעקב אחר פונקציות תא NK תת שונים בו זמנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת היא גישה קלה, מהירה ואמינה ללמוד פונקציות תא NK מדגימה דם שלם של תורמים או מטופלים בריאים. שיטה זו מציעה את היתרון הגדול לטהר תאי NK ישירות מדם כולו, הימנעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות זמן רבה, שהיא חובה עבור שיטות טיהור רבות אחרות 15. יתר על כן, זה דורש גוד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.
Materials
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0,4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
References
- Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
- Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
- Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
- Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
- Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
- Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
- Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
- Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
- Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
- Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
- Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
- Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
- Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
- Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
- Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
- Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
- Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
- Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
- Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
- Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
- Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
- Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
- Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
- Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
- Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
- Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
- Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
- Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).
