Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK
Summary
Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.
Abstract
Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.
Introduction
Come parte del natural killer del sistema immunitario innato (NK), le cellule contribuiscono alla prima linea di difesa contro le cellule infettate da virus o malignamente trasformati. Un sistema di recettori inibitori e attivatori consente loro di distinguere tra cellule sane e trasformate senza alcun priming antigene rispetto alle cellule T. Al momento dell'incontro delle cellule bersaglio cellule NK rilasciare il contenuto dei loro granuli citotossici (ad esempio, perforina, il granzimi) nella sinapsi immunitario per uccidere il loro obiettivo. Inoltre, le cellule NK producono e secernono diversi tipi di citochine (ad esempio, gamma interferone: IFN-γ; fattore di necrosi tumorale-α: TNF-α) e chemochine (ad esempio, macrofagi infiammatori proteina-1β: MIP-1b) su cellule bersaglio interazione o citochina stimolazione 1.
funzioni delle cellule NK sufficienti come la citotossicità, chemochine e la produzione di citochine hanno un impatto importante sulla sorte di diversi disfacilita. Pazienti affetti da leucemia mostrano un aumento tassi di recidiva se presentano un profilo delle cellule NK difettose al momento della diagnosi consiste di produzione di IFN-γ ridotta e ridotta espressione di attivare i recettori delle cellule NK 2. Un recupero precoce del numero di cellule NK e le funzioni, tra cui la produzione di citochine in seguito all'interazione cellula bersaglio è associato ad una ricaduta ridotta e il tasso di sopravvivenza migliore nei pazienti trattati con trapianto di cellule staminali allogeniche 3. Inoltre, dopo l'inizio della terapia con interferone nei pazienti con infezione da virus dell'epatite C la capacità degranulazione delle cellule NK periferiche è più forte nei primi responder rispetto ai non-responder 4. Il numero di cellule NK (> 80 / ml) al giorno 15 dopo il trapianto autologo di cellule staminali (trapianto autologo) in pazienti affetti da linfoma o mieloma multiplo sono predittivi per una migliore libera da progressione e la sopravvivenza globale 5. Nei pazienti affetti da melanoma l'espressione della cellule T immunoglobuline e mucina-domain-contenentg molecola-3 (TIM-3), una proteina immuno-normativo sulle cellule NK, correla con stadio di malattia e la prognosi 6.
Gli scienziati hanno monitorato le funzioni delle cellule NK nel corso degli ultimi decenni. L'analisi iniziale di citotossicità delle cellule NK contro le cellule tumorali senza obbligo di adescamento è stato affrontato con un saggio di 51 Cr-release 7. Più recentemente, gli scienziati hanno sviluppato un metodo non radioattivo per valutare la citotossicità delle cellule NK espanse 8. Citochine e chemochine è stato spesso valutata utilizzando test immunoenzimatico (ELISA) tecniche enzyme-linked 9,10. Nel corso degli ultimi decenni, questi metodi sono stati integrati da analisi di flusso citometria-based. L'uso di inibitori della proteina di trasporto (ad esempio, brefeldina A e monensin) e metodi di permeabilizzazione delle cellule in combinazione con protocolli di colorazione della superficie convenzionale ha permesso agli scienziati di studiare chemochine e la produzione di citochine in diversi linfa specificosottoinsiemi ocyte (ad esempio, T, B o cellule NK) 11. Inoltre, le analisi di citometria a base di diversi flussi sono stati sviluppati per monitorare T e NK citotossicità delle cellule. Nel 2004 Alter et al. Descrive l'espressione di superficie della proteina lisosomi associata CD107a (Lamp1) sulle cellule NK su incontro cellula bersaglio come marker per la degranulazione dei granuli citotossici 12. Dal momento che una vasta gamma di differenti fluorocromi e multicanale citometri a flusso sono disponibili ai nostri giorni, è diventato possibile monitorare contemporaneamente diverse funzioni delle cellule NK (citotossicità, citochine e chemochine produzione) in diverse sottopopolazioni di cellule NK. Questo diventa particolarmente importante in situazioni in cui la dimensione del campione è limitato, ad esempio, in biopsie o campioni di sangue di pazienti affetti da leucopenia.
Per provare le funzioni delle cellule NK globali, i saggi di citometria a base di diversa portata può essere efficacemente combinati. Theorell et al. Cellule NK stimolate da headonatori lthy con la linea di cellule tumorali K562 e analizzato la produzione di degranulazione, segnale dentro-fuori e chemochine NK tramite citometria di flusso 13. Recentemente sottogruppi di cellule NK, fenotipi e funzioni in pazienti con tumore durante trapianto autologo sono stati analizzati utilizzando flusso saggi citometria-based. E 'stato dimostrato che le cellule NK sono stati in grado di degranulano e produrre citochine / chemochine su riconoscimento delle cellule tumorali in momenti molto precoce dopo trapianto autologo 11.
Qui un protocollo è descritto per valutare le funzioni delle cellule NK mediante interazione con le cellule tumorali compresa la capacità di degranulazione, chemochine e produzione di citochine mediante un flusso assay citometria-based che consente di controllare le funzioni delle cellule NK in diversi sottoinsiemi simultaneamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto è un metodo facile, veloce e affidabile per studiare le funzioni delle cellule NK da campioni di sangue intero di donatori sani o pazienti. Questo metodo offre il grande vantaggio di purificare direttamente le cellule NK da sangue intero, evitando il tempo centrifugazione in gradiente di densità, che è obbligatorio per molti altri metodi di purificazione 15. Inoltre, si richiede una dimensione campione più piccolo rispetto ai metodi "classici" di isolamento delle cellule NK /…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.
Materials
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0,4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
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