An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.
Dendritiska celler (DC) är viktiga för att initiera immunsvar, bland annat genom sin förmåga att förvärva och pendel antigen till dränerande lymfkörteln (DLN). Mobiliseringen av DC till DLN är komplex och återstår att helt klarlagd under infektion. Häri beskrivs är användningen av en innovativ, enkel analys som bygger på fluorokromen 5- och 6-karboxifluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) att spåra migration av DC under trampdynan infektion med Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) i C57BL / 6-möss. Denna analys gör det möjligt karakterisering av huden DC delpopulationer som aktivt flyttar till dränering, Poplietallymfknutor LN som svar på BCG. Detta protokoll kommer från en BCG modell där flyttande hud DC: er identifierades genom flödescytometri. Analysen är älskvärd till studiet och identifiering av DC: er eller andra celler som hem till Poplietallymfknutor LN efter inokulering av mikrober, deras metaboliter eller andra inflammatoriskastimuli i fotsulan, och följaktligen för att studera faktorer som reglerar migrationen av dessa celler.
DCs lokaliserade i kroppsytor känner mikrober eller deras produkter, och på så sätt mobilisera via lymfkärl till dränerings LN (DLN) 1,2. Denna omlokalisering behövs för transport av mikrobiell antigen till DLN och den därav följande grundning av immunsvar mot den invaderande mikroben. Faktum är att blockad av eller fel på DCs migrera från den infekterade vävnaden till DLN dämpar T-cellsvaret 3-5. Följaktligen analyser utformade för att spåra migration vid enkelcellnivån är användbara för att hjälpa skriver migratory funktion till en given DC delmängd.
Det finns en stor mängd data om utnyttjande av huden DC till DLN. De senare står för en stor del av kunskapen om DC migration från inflammerade eller infekterade webbplatser 2. Detta är inte förvånande eftersom huden finns en stor population av DCs och är en mycket tillgänglig yta för experiment i laboratoriet musen. Flera tekniker har därför utvecklats för att bedömamigration av murina DC: er från huden till DLN 2. FITC hud målning är den i särklass vanligaste tillvägagångssättet. I denna analys fluorokromen fluorescein-5-isotiocyanat (FITC) framställes i en blandning med aceton och en kontaktirriterande. Denna cocktail appliceras på avhårade eller rakad hud och ackumuleringen av FITC-märkta celler i sin tur analyseras i DLN. Migration kan också studeras genom att injicera huden med fluorokrom-taggade nano- eller mikropartiklar, som möjliggör spårning av fagocytiska celler som har internaliserat det fluorescerande partiklar i huden. Lymfkärl kan också kanyl för att direkt extrahera migrerar DC från lymfan. Detta är dock tekniskt utmanande, särskilt i möss. Antalet DCs erhållna för efterföljande analys är också en begränsande faktor.
Trots många tidigare studier på hud DC migrering, kvarstår en bristen på information avseende hud DC mobilisering för att DLN efter vaccineringnation med Bacille Calmette-Guerin (BCG), den levande, försvagade stam av Mycobacterium bovis användas för att vaccinera mot M. tuberkulos. BCG inokuleras i huden, vilket orsakar en begränsad infektion som utlöser en T-hjälpar-celltypen en respons. Både DC delpopulationer som mobiliserar till DLN från BCG-infekterad hud och de faktorer som reglerar deras migration under denna process inte är helt klarlagda. I ljuset av det ovanstående drogs en enkel men ny metod utvecklats där fluorokromen 5- och 6-karboxifluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) injiceras in situ för att spåra migration av DC: er in i DLN 3. C57BL / 6-möss injiceras i den bakre trampdynan med en ymp av BCG och dagen före avlivning, injiceras försöksdjuren i samma trampdyna med en hög koncentration av CFSE. Tjugofyra timmar senare avlivas djuren och tömnings Poplietallymfknutor LN (PLN) avlägsnades och preparerades för flödescytometri. Denna analys gör det möjligt för identification av celler som migrerar över natten från trampdynan huden till DLN (Figur 1).
Vidare kan gen-riktade möss användas för att identifiera faktorer som krävs för celler att mobilisera till DLN. Med hjälp av denna analys, har författarna till denna rapport tidigare funnit att EpCAM låg CD11b hög migrations hud DC transport BCG till DLN i en process som regleras av interleukin-1-receptor och intracellulära adaptormolekyl MyD88 3. Protokollet för denna CFSE baserad migration assay som härrör från ovanstående rapport från Bollampalli et al. 3 där flödescytometri användes för att detektera och analysera flytt hud DC, beskrivs häri. Fördelarna och nackdelarna med denna analys diskuteras.
noDCs är specialiserade antigenpresenterande celler som kan svara på mikrobiell utmaning på kroppsytor genom att förvärva mikrobiell antigen och migrera till DLN via lymfkärlen. Där, DCs presentera detta antigen för T-celler på ett sätt som driver primära T-cellsvar. Processen för DC migrering från vävnad till DLN är därför mycket viktigt för att förstå hur en produktiv T-cellssvar initieras. Metoder för att mäta DC migration är därför mycket användbara i utspelas ovan.
En musmodell användes för att studera huden DC migration till DLN efter infektion med BCG, ett levande vaccin som injiceras kliniskt i huden. I linje är BCG injiceras i den bakre trampdynan för att efterlikna denna kutan väg för vaccinering. En enkel analys utvecklades och därmed införlivas i denna modell för att undersöka migration av huden DC delpopulationer från BCG ympning platsen i trampdynan huden dränerings PLN. Detta protokoll relies på injicera fluorokromen CFSE i samma trampdyna som tidigare fått BCG och därefter isolering av den dränerande PLN 24 tim senare för att analysera närvaron av CFSE-märkta celler genom flödescytometri. Även om det inte beskrivs i protokollet, kan LNS från denna inställning också framställas för analys av konfokalmikroskopi, för att studera migrationsprocesser såsom placeringen av migrations celler i LN 3. Dessutom har liknande resultat på BCG-utlöst hud DC migration erhållits med hjälp av både BCG Pasteur 1173P2 3 och BCG SSI 1331 14.
CFSE är vanligen används för att märka celler in vitro och för att spåra sådana märkta celler in vivo efter cellöverföringar 15. I det nuvarande protokollet men det var för att direkt märka hudceller in situ. Den molekylära grunden för CFSE märkning liknar FITC, som också är en aminreaktiv fluorescerande färgämne. CFSE är dock att föredra framför FITC för konjugering som det creates mycket stabila karboxamid obligationer 16. Dessutom är CFSE starkt membran genomsläpplig och passivt diffunderar in i celler. Väl inne, bildar den intracellulära amin (fluorescerande) konjugat som behålls i den märkta cellen 15.
Migrationen analys CFSE baserade utvecklats av författarna möjliggör identifiering av celler flyttar från huden till DLN inom en 24-timmarsperiod som svar på BCG. Den mäter alltså akut migration under en definierad tidsperiod och gör att man kan undersöka förmågan hos olika, injicerade stimuli för att utlösa migreringen. Denna analys skiljer sig från den klassiska tekniken med FITC hud målning, som mäter en kumulativ migration händelse utlöst av kutan, topikal applicering av en kontakt-sensibiliserande medel. Således kan CFSE-baserade migration analysen användas för att identifiera migrations hud DC eller andra celler som hem till PLN efter injektion av mikrober, mikrobiella produkter eller andra inflammatoriska retningar i footpad. Faktum är att både neutrofiler och γ: har ö T-celler visat att flytta från huden till DLN som svar på BCG 17,18. I själva verket var analysen nyligen använts i en samtidig infektion inställning för att visa att en gut-lokaliserad nematod infektion kan stänga BCG-utlöst hud DC migration till DLN 14.
DC migration bedöms ofta mellan 24-72 timmar i FITC hud målning sedan FITC-märkta DCs är svåra att upptäcka fyra till fem dagar efter målning 19. Förlust av CFSE signalen på märkt DC är inte en fråga i analysen presenteras här eftersom analys av migration begränsades till 24 h; Orsaken till detta är att författarna ville specifikt studera "över natten" migrationshändelser. Andra som är intresserade i denna analys men uppmuntras att undersöka tidigare eller ännu senare tidpunkter för CFSE-baserad spårning. Eftersom CFSE introduceras genom injektion kan ges vid varje bestämd tid. Denna flexibilitet möjliggjorde enuthors att bedöma DC migration mellan dag 5 och 6 efter BCG-infektion (figur 2C) 3. Injicera CFSE skulle kunna begränsa celltyper tillgängliga in situ till märkningsreaktionen. Till exempel Langerhans celler (ULF), som är DC som uppehåller sig i det översta lagret av huden, överhuden, migrera dåligt som svar på BCG i CFSE-baserade migration analysen (Figur 3) 3. Under FITC hud målning, DC placerade i dermis skiktet under överhuden, är lätt märkt och migrera till DLN snabbare än LC 20,21. Detta tyder på att celler kan bli fluorokrommärkta utan att nödvändigtvis behöva lokalisera till skiktet av huden där märkningen lösningen appliceras.
Som en modell för BCG-infektion, ger musen örat en bona fide intradermal rutt ympning som är mer i linje med den kliniska administrationen av BCG som tuberkulosvaccin. footpad injektion å andra sidan, är sannolikt en kombination av den intradermala och subkutana vägar. Som sagt, det kräver skicklighet och utbildning för att korrekt och reproducerbart leverera BCG till dermis 22, så i klinisk praxis kan inte alltid ges verkligen intradermal utan subkutan eller en kombination av båda. Som inokulationsstället fotsulan har två mycket tydliga fördelar jämfört med örat som förtjänar att nämnas. För det första är immunsvaret koncentrerades till dräneringen PLN efter en trampdynan injektion och detta underlättar undersökningen av reaktioner. Författarna till denna rapport fann PLN att vara den första och viktigaste LN dränering trampdynan 3. Andra har föreslagit delad dränering mellan knävecken och subiliac LNS efter injektion av Evans blå 23. Men i fråga om örat, det finns mer än ett öra DLN i möss och dessa kan inte vara regelbundet närvarande eller lätt att hitta 24. Den senare introducerar tydligt en LIABbilitet i studier som syftar till att undersöka svar i DLN. För det andra, kan större volymer inokuleras in i trampdynan (10-50 | il) jämfört med örat. Detta i sin tur både minimerar ansvar att införa stora förändringar i lymfatiska flödet och för att behöva arbeta med mycket små injektionsvolymer, vilket i sig är ett problem när det gäller att ympa stora mängder mykobakterier. I örat där injektionsvolymer måste vara liten (1-10 l), kan även 5 ^ ändra lymfatiska flödet och eventuellt tvinga fram en större mängd av det injicerade materialet direkt in i DLN på ett okontrollerat sätt. Det är därför viktigt att ta hänsyn till injektionsvolymer. Detta är särskilt viktigt i experiment adresse bidraget av celler i ferrying bakterier till LN. I BCG trampdynan modellen, kan en del BCG har nått DLN i frånvaro av cell transport. Detta grundar sig på observationen att man fortfarande kan detektera BCG i DLN av möss, där cellmigration från fotenkudden helt ablation genom lokal injektion av pertussistoxinet 3. Huruvida detta är en indikation på att BCG direkt kan få tillgång till lymfkärlen och nå DLN i en verkligt cellfritt sätt återstår att fastställa, eftersom det inte kan uteslutas att mykobakterier i detta fall få tillgång till lymfkärlen med våld av den injicerade volymen.
En praktisk fråga för vaccinationer i örat eller trampdynan är att djuren måste vara tillräckligt orörlig under injektioner utföras korrekt och på ett reproducerbart sätt. Isofluran gas beskrivs i det nuvarande protokollet som en metod för att hålla djur i förberedelse för trampdyna injektioner. De relativt snabb induktion och återhämtningstider för isofluran-medierad anestesi gör det till en populär metod, men liknar andra anestesimedel, påverkar det fysiologi, som kan störa experimentella resultat 25. I själva verket, både flyktiga och injicerbara anestetika minskar lymfflödet genom att avskaffafrivilliga muskelrörelser, vilket minskar muskeltonus och minskande lymphangion kontraktion 26. Dessutom har en minskning med 5 gånger i migrationen till DLN av DCs adoptivt överförd i fotsulan rapporterats i bedövade djur 27. Med tanke på ovanstående, och eftersom de procedurer före anestesi kan orsaka mer stress för djuren än själva injektionen, vilket är både snabb att administrera och kräver inte ett utvinningssteg, möjlighet att på ett adekvat hålla djuret utan bedövningsmedel bör vägas. En mus restrainer anpassad för trampdyna injektioner, där djuret kan snabbt bringas till en immobiliserad position och inokulerats i trampdynan inom 30-40 sek skulle vara idealiskt att injicera musen i bakre trampdynan utan att ändra andra aspekter av dess fysiologi i processen och skulle vara mycket användbart i studier som behandlar cellvandring genom lymfkärlen.
Sammanfattningsvis, den här rapportenbelyser ett nytt protokoll för att spåra hud DC under deras mobilisering till DLN användning av en analys som övervakar migration under en definierad 24-hr fönster. Detta CFSE-baserade migration analys möjliggör detektion och analys av migrations celler genom flödescytometri, som beskrivs här, liksom med konfokalmikroskopi 3. Den ger en flexibel plattform för att studera en mängd olika injicerade stimuli och deras förmåga att utlösa DC migration, och viktigare, kan användas för att spåra inte bara DCs utan även andra populationer som flyttar från huden för att DLN under olika experimentella inställningar.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Karolinska Institutet, a project grant from the Swedish Research Council VR (Dnr 2014-2794) and a KID Doctoral Grant from Karolinska Institutet (All to A.G.R). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
EDTA | In house | ||
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
PBS | In house | ||
Filtered water | In house | ||
BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
6 well plates | TPP | 92006 | |
15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
Univentor 400 anaesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Monojet 3/10ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
Antibody | Clone | Company | |
Antibodies | |||
MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
CD103 | 2E7 | Biolegend | |
CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
CD86 | GL-1 | Biolegend |