Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid
Summary
Microbiële consortia binnen bumble bee-hives verrijken en behouden van pollen voor larven van de honingbij. Met behulp van de volgende generatie sequencing, samen met laboratorium en veld gebaseerde experimenten, dit manuscript wordt beschreven protocollen gebruikt om te testen van de hypothese dat fungicide residuen veranderen de stuifmeel microbiome, en de kolonie demografie, uiteindelijk leidde tot de kolonie verlies.
Abstract
Kwekers gebruiken vaak fungicide sprays tijdens bloei te beschermen gewassen tegen ziekte, die bijen fungicide residuen blootstelt. Hoewel beschouwd als “bee-safe”, is er montage bewijs dat fungicide residuen in stuifmeel gekoppeld bee dalingen (voor zowel de honing en de bumble bee-soorten zijn). Terwijl de mechanismen nog relatief onbekend, hebben onderzoekers gespeculeerd dat bee-microbe symbiose zijn betrokken. Microben spelen een centrale rol in het behoud en/of de verwerking van stuifmeel, dat als voeding voor larvale bijen fungeert. Door een wijziging van de microbiële Gemeenschap, is het waarschijnlijk dat fungiciden deze microbe-mediated diensten en verstoren waardoor compromis gezondheid van de bijen. Dit manuscript beschrijft de protocollen voor het onderzoeken van de indirecte mechanism(s) door die fungiciden wordt veroorzaakt door de daling van de kolonie. Cage experimenten bloot bijen aan fungicide-behandelde bloemen hebt al het eerste bewijs dat fungiciden diepgaande kolonie in een inheemse bumble bee (Bombus impatiens verliezen) opgegeven. Met behulp van veld-relevante doses van fungiciden, een reeks experimenten zijn ontwikkeld om te voorzien van een fijnere beschrijving van microbiële Gemeenschap dynamiek van stuifmeel fungicide-blootgesteld. Verschuivingen in de structurele samenstelling van schimmel en bacteriële assemblages binnen de stuifmeel-microbiome worden door de volgende-generatie sequentie en metagenomic analyse onderzocht. Experimenten ontwikkeld hierin zijn ontworpen om een mechanistische begrip van de invloed van fungiciden op de microbiome van stuifmeel-bepalingen. Uiteindelijk, deze bevindingen moeten licht werpen op de indirecte route waarlangs fungiciden wordt veroorzaakt door dalingen van de kolonie.
Introduction
Beheerd en wilde bijen soorten ondervindt wijdverbreide dalingen, met grote gevolgen voor zowel natuur- en landbouw systemen1. Ondanks gezamenlijke inspanningen om te begrijpen van de oorzaken van dit probleem, zijn de factoren rijden honing honingbij dalingen nog steeds niet goed begrepen2,3,4. Voor bepaalde soorten van wilde, inheemse bijen, is de situatie geworden dire5,6. Als de bijenvolken kunnen niet worden gehandhaafd wanneer ze elkaar met de industriële landbouw snijden, hun bevolking zal blijven dalen en de gewassen waarvoor bestuivers (35% van de wereldwijde productie7) zal doorstaan verminderd oogsten.
Terwijl vele potentiële factoren zoals bestrijdingsmiddelen blootstelling, ziekte en habitat verlies1,4,8,9,10 zijn betrokken bij de daling van de bijen van de honing, relatief is weinig bekend over de interactieve effect van deze stressoren op inheemse bijen gezondheid, binnen of in de buurt van landbouwsystemen. Veel huidige onderzoeksinspanningen blijven richten op insecticiden (bijv, neonicotinoids11,12), hoewel afgelopen onderzoek wijst uit dat fungiciden ook een rol in de daling van de bee spelen kunnen door afbreuk te doen aan Geheugenvorming, olfactorische receptie13, nest erkenning14, enzymactiviteit en metabolische functies15,16,17. Wereldwijd blijven de Fungiciden op bloeiende gewassen worden toegepast tijdens de bloei. Recente studies hebben gedocumenteerd dat bijen brengen vaak fungicide residuen terug naar de korf18, inderdaad, studies hebben aangetoond een groot aantal geteste bijenkasten bevatte fungicide residuen19,20. Verdere werkzaamheden is gebleken dat fungicide residu wordt geassocieerd met hoge tarieven van honing honingbij larvale sterfte21,22,23 en de aanwezigheid van “entombed pollen” binnen de koloniën, die hoewel niet-toxisch, is verstoken van microbiële activiteit en voedingswaarde gecompromitteerde24. Ondanks het feit dat fungiciden hebben lang beschouwd als “bee-safe”, blijkt nu dat de blootstelling aan fungicide alleen kan leiden tot ernstige kolonie verliezen in een inheemse bumble bee soorten, Bombus impatiens25.
Om het oorzakelijk verband tussen blootstelling van de fungicide en kolonie sterfte, de werkwijze van deze chemische stoffen moeten worden bepaald. Blijkens in bodems26, sedimenten27en28van het aquatisch milieu, gericht op schimmels, fungiciden waarschijnlijk veranderen schimmel overvloed en diversiteit binnen de stuifmeel-bepalingen, waardoor het inroepen van een grote gemeenschap die verschuiving kan sterk gunst bacteriën. Zonder schimmel concurrenten of antagonisten, kunnen bepaalde pathogene bacteriën vermenigvuldigen relatief ongecontroleerde, vergemakkelijking van het bederf van stuifmeel-bepalingen. Afgelopen onderzoek heeft aangetoond dat micro-organismen, met name de gisten en filamenteuze schimmels, dienen als voeding symbionten voor bijen29,30,31, beschermen tegen parasieten en pathogenen32 ,33, en op lange termijn behoud van stuifmeel winkels bieden. Fungiciden, daarom kunnen niet indirect schade toebrengen aan onrijpe bijen door het verstoren van de microbiële Gemeenschap die nodig is om deze services te verstrekken en/of door het verhogen van de gevoeligheid voor opportunistische pathogenen en parasieten12. Met de toenemende eisen op de productie van levensmiddelen, zijn gewassen die wereldwijd wordt gespoten jaarlijks met fungiciden tijdens bloei, onderstrepen de noodzaak om te begrijpen de omvang van dergelijke fungicide-geïnduceerde effecten.
Tot op heden, de lacunes in de primaire kennis met betrekking tot inheemse honingbij microbiële ecologie kan worden vertegenwoordigd door de volgende vragen: in welke mate verandert fungicide de microbiële Gemeenschap in bijen stuifmeel-voorzieningen? Wat zijn de downstream effecten van de consumptie van stuifmeel met een ingrijpend gewijzigde microbiële Gemeenschap? Houden met deze ecologisch germane vragen, experimenten werden ontwikkeld met de belangrijkste doelstellingen van het openbaren van 1) dat alleen fungicide-residu kan leiden tot daling van de strenge kolonie in een inheemse honingbij soorten; 2) de mate waarop microbiële gemeenschappen in stuifmeel-bepalingen worden gewijzigd door fungiciden, en 3) hoe bee gezondheid wordt beïnvloed door een sterk veranderde microbiële Gemeenschap. De experimentele doelstellingen werden gedefinieerd om aan te pakken van de bovenstaande vragen met behulp van een combinatie van laboratorium en veld-gebaseerde experimenten. Met behulp van state-of-the-art metagenomic en moleculaire technieken naast traditionele methoden van veld observatie, dit onderzoek heeft tot doel om samen stuk van de potentiële gezondheidseffecten van fungiciden bee.
De eerste doelstelling van deze studie is om aan te tonen dat fungicide blootstelling alleen leiden aanzienlijke kolonie verliezen onder inheemse honingbij soorten tot kan. Een studie waarbij grote veld kooien werd gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van fungicide blootstelling op de groei van de kolonie van Bombus impatiens, een alomtegenwoordige, overvloedige inheemse honingbij in de VS (afbeelding 1, afbeelding 2, Figuur 3). Het was veronderstelde dat bijenkasten fungicide-behandeld voorleggen aan het zou lagere fitness en atypische demografie in vergelijking met niet-blootgesteld kasten. Gegevens die zijn verkregen uit dit experiment ondersteund deze hypothese, aan te tonen dat residuen van het fungicide binnen stuifmeel de enige oorzaak van diepe kolonie verliezen in een inheemse bumble bee soorten25kunnen zijn. De tweede doelstelling van deze studie is om te onderzoeken van de reactie van de stuifmeel-microbiome fungicide blootstelling. Het is veronderstelde dat de samenstelling van de Gemeenschap van microben in stuifmeel-bepalingen blootgesteld aan fungiciden van die van onbehandeld stuifmeel afwijken zullen. Terwijl schimmel overvloed diversiteit naar verwachting aanzienlijk afnemen, zal bacteriën en/of een één dominante schimmel soort waarschijnlijk groeien ongecontroleerde bij gebrek aan andere concurrerende schimmels. Door een reeks van in-vivo proeven, zal deze verschuivingen in microbiële Gemeenschap samenstelling worden geanalyseerd met behulp van metagenomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onderzoek naar de effecten van fungiciden op de gezondheid van de bijen zijn een understudied aspect van strategieën voor het beheer van pest gebleven. Onze studie streeft naar het overbruggen van deze kennis met behulp van een suite van complementaire technieken die expliciet het isoleren van de potentiële factoren rijden bee dalingen. De planning, beweegredenen en weergave van deze experimenten zijn hieronder.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat geen bijen zijn toegestaan om te ontsn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur (s) bedanken de Universiteit van Wisconsin biotechnologie Center DNA Sequencing faciliteit voor het verstrekken van versterking en sequencing faciliteiten en diensten, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto en Max Haase voor het verlenen van technische bijstand met moleculaire analyse. Dit werk werd gesteund door de USDA-agrarische zoekservice uitgetrokken middelen (huidige Research Information System #3655-21220-001). Verdere steun werd voorzien door de National Science Foundation (onder Grant nr. DEB-1442148), het DOE grote meren bio-energie Research Center (DOE Office van wetenschap BER DE-FC02-07ER64494), en de USDA nationale Instituut voor voeding en landbouw (Hatch project 1003258). C.T.H. is een geleerde van de Pew in de Biomedische Wetenschappen en een Alfred Toepfer faculteit Fellow, ondersteund door de Pew Charitable Trusts en de Alexander von Humboldt Foundation, respectievelijk.
Materials
| Natupol Beehive | Koppert | USRESM1 | 16 hives |
| Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
| Abound | Syngenta | 4033540 | Azoxystrobin 22.9% |
| Chlorothalonil | Syngenta | 3452 | Fungicide used for trials |
| Pollen granules | Bee rescued | B004D5650C | 3X 16oz bottles, pollen for trials |
| Bacterial strains for inoculation | Currie Lab | ||
| Yeast strains for inoculation | Hittinger lab | ||
| Primer pairs | UW Biotech Center | ||
| DNA Isolation Kit | Mo Bio | 12830-50 | Commercial DNA isolation kit |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification tool |
| Select Master Mix for CFX | Thermo Fisher | 4472952 | Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye. |
| Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855196 | Instrument used for PCR amplification |
| PCR Clean-Up Kit, | Axygen | 10159-696 | Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes |
| DNA 1000 Kit | Agilent | 5067-1504 | Used for sizing and analysis of DNA fragments |
| MiSeq Sequencer | Illumina | Used for next-generation sequencing | |
| Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) | VWR |
References
- Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
- Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, S80-S95 (2010).
- Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
- Vanbergen, A. J. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
- Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
- Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines?. Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
- Klein, A. -. M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
- Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? – A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
- Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
- Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
- Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
- Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
- Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
- Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
- Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
- Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
- Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
- David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
- Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
- Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
- van Engelsdorp, D., et al. “Entombed Pollen”: A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
- Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
- Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
- Huang, C. -. Y., Ho, C. -. H., Lin, C. -. J., Lo, C. -. C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
- Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
- Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
- Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
- Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
- Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
- Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency?. Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
- User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf (2010)
- Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
- Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
- White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , (2015).
- Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
- Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
- Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
- Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
- Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
- Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
- Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
- Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
- Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals?. Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).
