Techniques de calcul empirique et métagénomique éclairent les mécanismes de fongicides compromis Bee santé
Summary
Les consortiums microbiens dans les ruches de bourdons enrichissent et conserver le pollen pour les larves d’abeilles. Prochaine génération séquençage, ainsi que le laboratoire et les expériences sur le terrain, ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour vérifier l’hypothèse que des résidus de fongicide modifient le microbiome du pollen et la démographie de colonie, conduisant finalement à la colonie perte.
Abstract
Les producteurs utilisent souvent les pulvérisations pendant la floraison pour protéger les cultures contre les maladies, qui expose les abeilles à des résidus de fongicide. Bien que considéré comme « abeille-safe », il y a des preuves grandissantes que des résidus de fongicide dans le pollen sont associés à des déclins d’abeille (pour les espèces d’abeilles de miel et de bourdons). Alors que les mécanismes restent relativement peu connus, les chercheurs ont émis l’hypothèse que symbioses abeille-microbe sont impliqués. Microbes jouent un rôle essentiel dans la conservation et/ou de transformation de pollen, qui sert de nutrition pour les abeilles larvaires. En altérant la communauté microbienne, il est probable que les fongicides perturbent ces services induite par le microbe et ainsi compromettent la santé des abeilles. Ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour étudier les mécanismes indirects par lequel fongicides peuvent être responsables de déclin de la colonie. Expériences de cage exposition des abeilles aux fleurs traitées par des fongicides ont déjà fourni la première preuve que fongicides causent des pertes de colonies profonde dans un natif bourdon (Bombus impatiens). À l’aide de champ les doses de fongicides, une série d’expériences ont été développés afin de fournir une description plus fine de la dynamique des communautés microbiennes de pollen exposés au fongicide. Changements dans la composition structurelle des assemblages fongiques et bactériennes dans le microbiome du pollen sont étudiés par séquençage de prochaine génération et analyse métagénomique. Expériences élaborées dans cet article ont été conçues pour fournir une interprétation mécaniste de l’incidence des fongicides sur le microbiome du pollen-dispositions. En fin de compte, ces résultats devraient faire la lumière sur la voie indirecte, à travers lequel fongicides peuvent être responsables de déclin de la colonie.
Introduction
Géré et espèces d’abeilles sauvages connaissent des baisses généralisées, avec des implications majeures pour les deux systèmes naturels et agricoles1. Malgré les efforts concertés pour comprendre les causes de ce problème, les facteurs à l’origine de miel abeille baisses ne sont pas encore bien compris2,3,4. Pour certaines espèces d’abeilles sauvages, indigènes, la situation est devenue grave5,6. Si les populations d’abeilles ne saurait être maintenues lorsqu’elles se croisent avec l’agriculture industrielle, leurs populations continuent de baisser et les cultures nécessitant des pollinisateurs (35 % de la production mondiale7) durera réduit les récoltes.
Alors que de nombreux facteurs potentiels tels que l’exposition aux pesticides, maladies et habitat perte1,4,8,9,10 ont été impliqués en déclin d’abeille miel, On connaît assez l’effet interactif de ces facteurs de stress sur la santé des abeilles indigènes, au sein ou à proximité des systèmes agricoles. De nombreux efforts de recherche actuels continuent de se concentrer sur les insecticides, (p. ex., néonicotinoïdes11,12), bien que des recherches antérieures indiquent que fongicides peuvent également jouer un rôle dans le déclin de l’abeille en altérant la formation de la mémoire, réception olfactive13, nid reconnaissance14, l’activité enzymatique et fonctions métaboliques15,16,17. Dans le monde, fongicides continuent de s’appliquer aux cultures de floraison pendant la floraison. Des études récentes démontrent que les abeilles ramener couramment des résidus de fongicide à la ruche18, en effet, des études ont montré une forte proportion des ruches testés contenaient des résidus fongicide19,20. Poursuite des travaux a révélé que les résidus fongicide sont associée à des taux élevés de miel abeille la mortalité larvaire21,22,23 et la présence de « pollen enseveli » au sein de colonies, qui bien que non toxique, est dépourvu d’activité microbienne et nutritionnellement compromis24. Malgré le fait que fongicides ont longtemps été considérés comme « abeille-safe », il est désormais établi que l’exposition aux fongicides seul peut causer des pertes sévères colonie dans une espèces de bourdons native, Bombus impatiens25.
Pour établir le lien de causalité entre l’exposition de fongicide et colonie de mortalité, modus operandi de ces produits chimiques doivent être déterminées. Comme en témoigne les sols26, sédiments27et28de milieux aquatiques, en ciblant les champignons, fongicides probables modifient fongique abondance et la diversité au sein de pollen-dispositions, invoquant ainsi une très importante communauté shift qui peut fortement favoriser les bactéries. Sans concurrents fongiques ou antagonistes, certaines bactéries pathogènes peuvent proliférer relativement non coché, facilitant la détérioration des dispositions en matière de pollen. Recherches antérieures a démontré que les microorganismes, en particulier les levures et les champignons, servent de symbiotes nutritionnels pour abeilles29,30,31, protéger contre les parasites et agents pathogènes32 ,33et prévoir la conservation à long terme du pollen magasins. Fongicides, par conséquent, peuvent nuire indirectement abeilles immatures en perturbant la communauté microbienne qui est nécessaire pour fournir ces services, et/ou en augmentant la sensibilité aux agents pathogènes et parasites opportunistes12. Avec l’augmentation des demandes sur la production alimentaire, les cultures dans le monde entier sont à peindre chaque année avec des fongicides pendant la floraison, soulignant la nécessité de comprendre l’ampleur de ces effets induits par le fongicide.
À ce jour, les lacunes de connaissances primaires relatives aux abeilles indigènes microbienne écologie peut être représenté par les questions suivantes : dans quelle mesure le fongicide modifie-t-elle la communauté microbienne au pollen d’abeille-dispositions ? Quels sont les impacts en aval de la consommation de pollen avec une communauté microbienne profondément altérée ? En gardant ces questions pertinentes sur le plan écologique, des expériences ont été élaborés avec les principaux objectifs de révéler 1) que seuls les résidus fongicide peuvent causer la colonie grave déclin dans une espèce d’abeilles indigènes ; 2) le degré auquel des communautés microbiennes dans les dispositions en matière de pollen sont altérées par fongicides et 3) Comment la santé des abeilles est affectée par une communauté microbienne gravement altérée. Les objectifs expérimentaux ont été définies pour répondre aux questions ci-dessus en utilisant une combinaison d’expériences de laboratoire – et sur le terrain. À l’aide d’état-of-the-art métagénomique et techniques moléculaires avec les méthodes traditionnelles d’observation sur le terrain, cette recherche vise à reconstituer les effets potentiels des fongicides sur la santé des abeilles.
Le premier objectif de cette étude est de démontrer que l’exposition fongicide seule peut entraîner des pertes de colonie importante parmi les espèces d’abeilles indigènes. Une étude portant sur les cages de grand champ a été utilisée pour étudier les effets de l’exposition de fongicide sur la croissance de la colonie Bombus impatiens, une abeille indigène omniprésente et abondante aux États-Unis (Figure 1, Figure 2, Figure 3). L’hypothèse a été que les ruches traitées par des fongicides présentera une aptitude inférieure et démographie atypique par rapport aux ruches non exposés. Données tirées de cette expérience appuient cette hypothèse, en démontrant que des résidus de fongicide dans le pollen peuvent être la seule cause des pertes de colonie profonde dans un natif bumble bee espèces25. Le deuxième objectif de cette étude est d’étudier la réponse du microbiome du pollen à l’exposition de fongicide. Il est possible que la composition de la communauté des microbes dans pollen-dispositions exposées aux fongicides sera différente de celle du pollen non traitée. Alors que la diversité et l’abondance de champignon devraient diminuer considérablement, bactéries ou une seule espèce fongique dominante augmentera probablement incontrôlée en l’absence d’autres champignons concurrentes. Grâce à une série d’essais in vivo , ces changements dans la composition des communautés microbiennes seront analysées à l’aide de métagénomique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recherches sur les effets des fongicides sur la santé des abeilles sont restées un aspect peu étudiée de stratégies de lutte antiparasitaire. Notre étude vise à combler cette lacune à l’aide d’un ensemble de techniques complémentaires qui isolent explicitement les facteurs possibles baisses de l’abeille. La planification, la justification et le rendu de ces expériences sont détaillées ci-dessous.
Il est important de s’assurer qu’aucune abeille n’est autorisés à s’é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur remercie l’installation de séquençage ADN Université du Wisconsin Biotechnology Center permettant l’amplification et installations de séquençage et de services, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto et Max Haase pour fournir une assistance technique avec analyse moléculaire. Ce travail a été soutenu par les fonds de l’USDA-Agricultural Research Service ouvert (Current Research Information System #3655-21220-001). A été confortée par la National Science Foundation (sous le Grant No. DEB-1442148), le centre de recherche de bioénergie DOE Great Lakes (DOE Bureau des sciences DE BER-FC02-07ER64494) et l’USDA National Institute of Food et Agriculture (Hatch projet 1003258). C.T.H. est un érudit de Pew en Sciences biomédicales et Alfred Toepfer Faculté Fellow, appuyé par le Pew Charitable Trusts et la Fondation Alexander von Humboldt, respectivement.
Materials
| Natupol Beehive | Koppert | USRESM1 | 16 hives |
| Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
| Abound | Syngenta | 4033540 | Azoxystrobin 22.9% |
| Chlorothalonil | Syngenta | 3452 | Fungicide used for trials |
| Pollen granules | Bee rescued | B004D5650C | 3X 16oz bottles, pollen for trials |
| Bacterial strains for inoculation | Currie Lab | ||
| Yeast strains for inoculation | Hittinger lab | ||
| Primer pairs | UW Biotech Center | ||
| DNA Isolation Kit | Mo Bio | 12830-50 | Commercial DNA isolation kit |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification tool |
| Select Master Mix for CFX | Thermo Fisher | 4472952 | Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye. |
| Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855196 | Instrument used for PCR amplification |
| PCR Clean-Up Kit, | Axygen | 10159-696 | Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes |
| DNA 1000 Kit | Agilent | 5067-1504 | Used for sizing and analysis of DNA fragments |
| MiSeq Sequencer | Illumina | Used for next-generation sequencing | |
| Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) | VWR |
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